一种偶联的CRISPR和毒素-抗毒素元件及其在消杀耐药细菌中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体公开通过联用CRISPR及其偶联的毒素

【技术实现步骤摘要】
antibiotic
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resistant bacteria.Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 9; 112(23): 7267
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7272.)。然而，该技术在实际应用中存在诸多限制。
[0005]首先，需要针对要消杀的目标耐药菌株筛选到可用的烈性噬菌体，而由于噬菌体往往具有高度的宿主特异性，即对同一物种中不同菌株的侵染能力差异很大，这严重限制了该技术在复杂的自然菌群中的实际应用。
[0006]其次，需要对烈性噬菌体进行人工改造（插入耐药基因的部分序列作为gRNA靶点），使其能够被靶向耐药基因的gRNA同时靶向，这就需要针对不同耐药基因设计不同的联用噬菌体，缺乏通用性(Ido Yosefet al.,Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic
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resistant bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 9; 112(2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由毒素元件和抗毒素元件组合构成的偶联元件,其中两者直接连接在一起，或并不连接在一起而组合构成所述元件；其中毒素元件含有启动子序列（例如启动子可以是常用的tac启动子或者J23119启动子序列，优选为PcreT启动子），SD序列及mini
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ORF毒素序列元件，用于表达毒素；抗毒素元件含有启动子序列（例如启动子可以是常用的tac启动子或者J23119启动子序列，优选为PcreA启动子）和类mini
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CRISPR结构，可以经转录加工产生CreARNA；优选地所述类mini
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CRISPR结构的第一个repeat序列不保守但有保守的茎环结构，第二个repeat序列和结构都非常保守。2.如权利要求1所述的偶联元件，其特征在于，所述毒素元件和抗毒素元件直接连接，或者分别在同一载体的不同位置，或者分别在不同载体上偶联构成所述元件。3.如权利要求1所述的偶联元件，其特征在于，所述PcreT启动子的序列如下：TACTTAGTAATGATAAGTCTTTTTATTTTACATAGAAATAGCTTGTGGAATAAAAGAAAAATCTGTATTTTACTTGTTATGGTTACTTTTAGTTTGAATTAAAGTAACTAGGTTTAATATTTAAATAAAGATTAACCATCGATCTGGCAGGATCACACATCACCCGATAGGG；所述SD序列及mini
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ORF毒素序列元件，例如用于表达蛋白类毒素或者RNA毒素，如MazF，ccdB蛋白，优选地，所述毒素为creT，更具体地，所述SD序列及mini
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ORF毒素序列元件的序列如下：TAAGGGGGAAATAATGTTTAGCACGCATTTAATCAGAAGGGTCTGA；所述PcreA启动子序列如下:ATACAGATTTTTCTTTTATTCCACAAGCTATTTCTATGTAAAATAAAAAGACTTATCATTACTAAGTA；所述类mini
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CRISPR结构的序列如下：AGGCACTACCATAAAGGTAGCTTAGAAATAGTTCCTTTTATTCAATCTGTTCATGGCGGCATACGCCATTTAGAAA。4.如权利要求3所述的偶联元件，其特征在于，所述毒素元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：TACTTAGTAATGATAAGTCTTTTTATTTTACATAGAAATAGCTTGTGGAATAAAAGAAAAATCTGTATTTTACTTGTTATGGTTACTTTTAGTTTGAATTAAAGTAACTAGGTTTAATATTTAAATAAAGATTAACCATCGATCTGGCAGGATCACACATCACCCGATAGGGTAAGGGGGAAATAATGTTTAGCACGCATTTAATCAGAAGGGTCTGA；所述抗毒素元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：ATACAGATTTTTCTTTTATTCCACAAGCTATTTCTATGTAAAATAAAAAGACTTATCATTACTAAGTAAGGCACTACCATAAAGGTAGCTTAGAAATAGTTCCTTTTATTCAATCTGTTCATGGCGGCATACGCCATTTAGAAA。5.一种偶联的CRISPR
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Cas和毒素
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抗毒素组合元件，包括来自鲍曼不动杆菌AYE菌株的cas3基因和四个csy基因构成的cas基因元件、含有靶向耐药基因spacer的mini
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CRISPR结构元件，以及如权利要求1至4任一项所述的偶联元件...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，王锐，舒宪，程飞跃，杨俊，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：