用于判断早期肝细胞癌的肿瘤标志物、试剂盒及其使用方法技术

本申请实施例公开了一种用于判断早期肝细胞癌的肿瘤标志物、试剂盒及其使用方法。本申请实施例的试剂盒以如SEQ ID NO.1所示的第一DNA和/或如SEQ ID NO.2所示的第二DNA作为判断标志物，通过判断离体样本中第一DNA和/或第二DNA中CpG位点的甲基化程度来判定该离体样本是否为早期肝细胞癌阳性样本，从而提示源于该离体样本的生物体是否发生早期肝细胞癌病变。本申请实施例的试剂盒基于其特定的肿瘤标志物，对早期肝细胞癌的阳性判断具有良好的特异性和灵敏度，可应用于早期肝细胞癌的筛查和判断。和判断。

【技术实现步骤摘要】
用于判断早期肝细胞癌的肿瘤标志物、试剂盒及其使用方法


[0001]本申请涉及生物医学
，具体涉及用于判断早期肝细胞癌的肿瘤标志物、试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]肝癌，尤其是肝细胞癌是中国常见的恶性肿瘤之一。大部分肝细胞癌患者一经发现就是中晚期，其中位生存期仅为1到1.5年，而早期肝细胞癌的5年术后生存率超过70％，因此，肝细胞癌的早筛、早诊、早治可极大改善患者的预后。
[0003]目前，常用甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)作为血液标志物来用于肝细胞癌的早期判断。然而，甲胎蛋白在检测时容易受到血液中的酶等诸多因素的影响，导致其在用作判断早期肝细胞癌的血液标记物时存在灵敏度和特异性不足的问题。

技术实现思路

[0004]本申请实施例提供一种用于判断早期肝细胞癌的肿瘤标志物、试剂盒及其使用方法，能够解决采用甲胎蛋白判断早期肝细胞癌时存在的灵敏度和特异性不足的问题。
[0005]本申请实施例提供了一种分离的肿瘤标志物或肿瘤标志物组合作为早期肝细胞癌的肿瘤标志物的用途，肿瘤标志物包括：第一DNA和/或第二DNA。第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。第一DNA和第二DNA不仅包括DNA的碱基排列顺序信息，也包括自然存在的DNA片段物质。第一DNA和第二DNA各自独立地包括甲基化CpG位点和/或未甲基化CpG位点。
[0006]可选地，在一些实施例中，用作肿瘤标志物的第一DNA和/或第二DNA的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。在另一些实施例中，用作肿瘤标志物的第一DNA和/或第二DNA的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
[0007]本申请实施例提供了一种分离的肿瘤标志物或肿瘤标志物组合作为用于判定离体样本是否为早期肝细胞癌阳性样本的试剂盒的判断对象的用途，肿瘤标志物组合包括：第一DNA和/或第二DNA。第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。第一DNA和第二DNA各自独立地包括甲基化CpG位点和未甲基化CpG位点。
[0008]可选地，在一些实施例中，用作肿瘤标志物的第一DNA和/或第二DNA的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。在另一些实施例中，用作肿瘤标志物的第一DNA和/或第二DNA的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
[0009]可选地，在一些实施例中，第一DNA选自基因组坐标为chr15:83284254
‑
83284648的BNC1基因。第二DNA选自基因组坐标为chr11:93330461
‑
93330772的DEUP1基因。
[0010]本申请实施例提供了一种用于鉴定早期肝细胞癌阳性样本的试剂盒。该试剂盒通过鉴定某个离体样本是否为早期肝细胞癌阳性样本来提示早期肝细胞癌。该试剂盒包括：转化试剂、第一扩增引物对和第一荧光标记物。在其它的实施例中，该试剂盒还可以包括第
二扩增引物对和第二荧光标记物。在其它的实施例中，该试剂盒还可以包括PCR扩增试剂。
[0011]在一些实施例中，转化试剂能够将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第一转化后DNA甲链；转化试剂还能够将cfDNA样本中不含有甲基化CpG位点的第一DNA中的所有胞嘧啶都转化为尿嘧啶，得到第一转化后DNA乙链。第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]在一些实施例中，转化试剂还能够将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第二转化后DNA甲链，将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第二转化后DNA乙链。第二DNA如SEQ ID NO.2所示。在一些实施例中，转化试剂包括亚硫酸氢盐。
[0013]在一些实施例中，第一扩增引物对用于PCR扩增第一转化后DNA甲链。第一荧光标记物包括依次相连的第一发光分子、第一寡聚核苷酸和第一淬灭分子。含有甲基化CpG位点的第一DNA在转化为第一转化后DNA甲链之后，未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，但是CpG位点中甲基化的胞嘧啶仍保持不变；不含有甲基化CpG位点的第一DNA被转化为第一转化后DNA乙链之后，所有胞嘧啶都被转化为尿嘧啶。因此，第一转化后DNA甲链与第一转化后DNA乙链的核苷酸序列存在不同。而本申请实施例中的第一扩增引物对和第一荧光标记物针对第一转化后DNA甲链进行设计，故其能够特异性扩增和结合第一转化后DNA甲链，而并不会扩增或结合第一转化后DNA乙链。
[0014]在一些实施例中，第二扩增引物对用于PCR扩增第二转化后DNA分子。第二荧光标记物包括依次相连的第二发光分子、第二寡聚核苷酸和第二淬灭分子。含有甲基化CpG位点的第二DNA在转化为第二转化后DNA甲链之后，未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，但是CpG位点中甲基化的胞嘧啶仍保持不变；不含有甲基化CpG位点的第二DNA被转化为第二转化后DNA乙链之后，所有胞嘧啶都被转化为尿嘧啶。因此，第二转化后DNA甲链与第二转化后DNA乙链的核苷酸序列存在不同。而本申请实施例中的第二扩增引物对和第二荧光标记物针对第二转化后DNA甲链进行设计，故其能够特异性扩增和结合第二转化后DNA甲链，而并不会扩增或结合第二转化后DNA乙链。
[0015]在一些实施例中，cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中，第一寡聚核苷酸对应整合入每条新扩增的第一转化后DNA甲链中，并且第一发光分子与第一淬灭分子相分离。当第一发光分子与第一淬灭分子相分离后，第一发光分子的荧光发射不受第一淬灭分子的淬灭作用的影响。但是第一寡聚核苷酸并不会对应整合入第一转化后DNA乙链中。
[0016]在一些实施例中，cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中，第二寡聚核苷酸对应整合入每条新扩增的第二转化后DNA甲链中，并且第二发光分子与第二淬灭分子相分离。当第二发光分子与第二淬灭分子相分离后，第二发光分子的荧光发射不受第二淬灭分子的淬灭作用的影响。但是第二寡聚核苷酸并不会对应整合入第二转化后DNA乙链中。
[0017]在一些实施例中，第一发光分子和第二发光分子各自独立地选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX。
[0018]在一些实施例中，第一发光分子和第二发光分子为不同种类的发光分子。
[0019]在一些实施例中，cfDNA样本来自血液、血浆或血清。
[0020]在一些实施例中，PCR为荧光定量PCR，例如为甲基化特异性荧光定量PCR。
[0021]在一些实施例中，第一扩增引物对包括第一上游引物和第一下游引物。第一上游
引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0022]在一些实施例中，第二扩增引物对包括第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的肿瘤标志物作为早期肝细胞癌的肿瘤标志物的用途，所述肿瘤标志物包括：第一DNA和/或第二DNA，所述第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种分离的肿瘤标志物作为用于判定离体样本是否为早期肝细胞癌阳性样本的试剂盒的判断对象的用途，所述肿瘤标志物包括：第一DNA和/或第二DNA；所述第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；可选地，所述第一DNA选自基因组坐标为chr15:83284254
‑
83284648的BNC1基因；和/或所述第二DNA选自基因组坐标为chr11:93330461
‑
93330772的DEUP1基因。3.一种用于鉴定早期肝细胞癌阳性样本的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：转化试剂，将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第一转化后DNA甲链，将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的所述第一DNA中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第一转化后DNA乙链；所述第一DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第二转化后DNA甲链，将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶，得到第二转化后DNA乙链，所述第二DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；第一扩增引物对，用于PCR扩增所述第一转化后DNA甲链，以及，第一荧光标记物，包括依次相连的第一发光分子、第一寡聚核苷酸和第一淬灭分子；和/或，第二扩增引物对，用于PCR扩增所述第二转化后DNA甲链，以及，第二荧光标记物，包括依次相连的第二发光分子、第二寡聚核苷酸和第二淬灭分子；其中，所述PCR为甲基化特异性荧光定量PCR。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一发光分子和所述第二发光分子各自独立地选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX；和/或所述第一发光分子和所述第二发光分子为不同种类的发光分子；和/或所述cfDNA样本来自血液、血浆或血清；和/或所述第一扩增引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；和/或所述第二扩增引物对包括第二上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和/或所述第一寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；和/或所述第二寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：第三扩增引物对，用于PCR扩增所述cfDNA样本中的参照基因；以及第三荧光标记物，包括依次相连的第三发光分子、第三寡聚核苷酸和第三淬灭分子。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述参照基因选自ACTB基因、RNasn P基因、GAPDH基因、TBP基因、HPRT基因中的任意一种；和/或所述第三扩增引物对包括第三上游引物和第三下游引物，所述第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；和/或所述第三寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；和/或
所述第三发光分子选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX；和/或所述第三发光分子与所述第一发光分子、所述第二发光分子为不同种类的发光分子。7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：提取试剂，从离体样本中提取到所述cfDNA样本；和/或所述转化试剂包括亚硫酸氢盐；和/或PCR扩增试剂，利用所述第一扩增引物对和所述第一荧光标记物对所述第一转化后DNA甲链进行P...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪永坤，
申请(专利权)人：泰州竹石医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：