一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用，涉及分子生物学与合成生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌Synbio

【技术实现步骤摘要】
一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学及合成生物学
，具体涉及一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着合成生物学的发展，人工合成、设计改造的尺度越来越大，由以往的基因片段、单个代谢途径向多个代谢途径乃至完整基因组拓展。随着研究需求的发展，DNA组装技术面临着越来越大的挑战。近年来，DNA组装技术不断发展，小片段DNA组装技术已经相对成熟稳定。小片段DNA组装多采用体外酶法组装，如依赖于高保真聚合酶的重叠延伸PCR法(OE
‑
PCR)、依赖于内切酶和连接酶的Golden Gate法、依赖于核酸外切酶、连接酶和DNA聚合酶协同作用的等温同源重组法(Gibson)等。但大片段DNA由于分子量大、易断裂、易形成二级结构，使得体外组装的效率低下且易发生碱基变异，因此大片段DNA主要利用微生物细胞的重组能力进行体内重组。常见的体内组装宿主主要是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等模式生物，其中酿酒酵母因其承载力高、同源重组效率高，已是大片段DNA组装的第一选择。研究表明，DNA片段的长度、数量、重组臂大小等因素与组装成功率显著负相关，目前常规的酿酒酵母已无法满足DNA合成领域日益增长的需求。如何进一步提高酿酒酵母体内组装的效率及DNA尺寸是目前亟待解决的问题。
[0003]酿酒酵母体内存在非同源连接(Non
‑
homologous end joining，NHEJ)及同源重组(Homologous recombination，HR)两种线性DNA组装模式。其中，同源重组过程决定了转入DNA片段最终组装构建的完整性和保真度，是大片段DNA体内组装的关键过程。但通过基因编辑手段，在酿酒酵母中进一步提高大片段DNA组装能力的专利未见报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌，经过改造后的基因工程酵母菌可作为大片段DNA的组装平台，广泛且高效地组装大片段DNA。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌，所述基因工程酵母菌是以酿酒酵母为原始菌株经基因编辑得到；所述基因编辑包括如下任意一种：1)敲除Ku基因；2)敲除Ku基因并在敲除位点插入ScRad52
‑
M基因表达框；3)敲除Ku基因并过表达ScRad52基因。
[0007]优选的，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母BY4741；所述Ku基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的，所述ScRad52
‑
M基因表达框包含GAP启动子、ScRad52
‑
M基因和ADH1终止子；所述GAP启动子、ScRad52
‑
M基因、ADH1终止子及ScRad52
‑
M基因表达框的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示。
[0009]优选的，所述过表达ScRad52基因具体为：
[0010]在所述酿酒酵母基因组ScRad52基因前插入GAP启动子；所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术还提供了上述基因工程酵母菌的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0012]以酿酒酵母为原始菌株，通过CRISPR/Cas9系统敲除基因组上的Ku基因，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1；
[0013]在基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将ScRad52
‑
M基因表达框整合到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1中的敲除位点，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc2；
[0014]在基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将GAP启动子整合到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1中ScRad52基因前，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc3。
[0015]优选的，通过如下步骤敲除基因组上的Ku基因：
[0016]分别构建pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒，将从pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒中回收得到的Donor
‑
ku70线性DNA片段和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒共同转化至酿酒酵母BY4741，经离心、孵育、培养后进行PCR筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1。
[0017]优选的，所述pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒是由Donor
‑
ku70基因片段组装至pUC57
‑
Kan载体上所得；所述Donor
‑
ku70基因片段的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示；
[0018]所述pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒是由sgRNA
‑
ku70基因片段组装至CRIPSR载体上所得；所述sgRNA
‑
ku70基因片段的核苷酸序列SEQ ID NO.7所示。
[0019]优选的，通过如下步骤将ScRad52
‑
M基因表达框整合到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1中的敲除位点：
[0020]分别构建pUC57
‑
Donor
‑
Rad52质粒和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒，将从pUC57
‑
Donor
‑
Rad52质粒中回收得到的Donor
‑
Rad52线性DNA片段和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒共同转化至酿酒酵母BY4741，经离心、孵育、培养后进行PCR筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc2；
[0021]所述pUC57
‑
Donor
‑
Rad52质粒是由Donor
‑
Rad52基因片段组装至pUC57
‑
Kan载体上所得；所述Donor
‑
Rad52基因片段的核苷酸序列SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌，其特征在于，所述基因工程酵母菌是以酿酒酵母为原始菌株经基因编辑得到；所述基因编辑包括如下任意一种：1)敲除Ku基因；2)敲除Ku基因并在敲除位点插入ScRad52
‑
M基因表达框；3)敲除Ku基因并过表达ScRad52基因。2.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母BY4741；所述Ku基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述ScRad52
‑
M基因表达框包含GAP启动子、ScRad52
‑
M基因和ADH1终止子；所述GAP启动子、ScRad52
‑
M基因、ADH1终止子及ScRad52
‑
M基因表达框的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述过表达ScRad52基因具体为：在所述酿酒酵母基因组ScRad52基因前插入GAP启动子；所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.权利要求1所述基因工程酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：以酿酒酵母为原始菌株，通过CRISPR/Cas9系统敲除基因组上的Ku基因，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1；在基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将ScRad52
‑
M基因表达框整合到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1中的敲除位点，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc2；在基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将GAP启动子整合到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1中ScRad52基因前，得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc3。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，通过如下步骤敲除基因组上的Ku基因：分别构建pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒，将从pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒中回收得到的Donor
‑
ku70线性DNA片段和pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒共同转化至酿酒酵母BY4741，经离心、孵育、培养后进行PCR筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株Synbio
‑
Sc1。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述pUC57
‑
Donor
‑
ku70质粒是由Donor
‑
ku70基因片段组装至pUC57
‑
Kan载体上所得；所述Donor
‑
ku70基因片段的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示；所述pCas9
‑
sgRNA
‑
ku70质粒是由sgRNA

【专利技术属性】
技术研发人员：徐杰，柳伟强，徐曾妮，李美美，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：