一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用，涉及分子生物学与合成生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌Synbio

【技术实现步骤摘要】
一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学及合成生物学
，具体涉及一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌、构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着合成生物学的发展，人工合成、设计改造的尺度越来越大，由以往的基因片段、单个代谢途径向多个代谢途径乃至完整基因组拓展。随着研究需求的发展，DNA组装技术面临着越来越大的挑战。近年来，DNA组装技术不断发展，小片段DNA组装技术已经相对成熟稳定。小片段DNA组装多采用体外酶法组装，如依赖于高保真聚合酶的重叠延伸PCR法(OE
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PCR)、依赖于内切酶和连接酶的Golden Gate法、依赖于核酸外切酶、连接酶和DNA聚合酶协同作用的等温同源重组法(Gibson)等。但大片段DNA由于分子量大、易断裂、易形成二级结构，使得体外组装的效率低下且易发生碱基变异，因此大片段DNA主要利用微生物细胞的重组能力进行体内重组。常见的体内组装宿主主要是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等模式生物，其中酿酒酵母因其承载力高、同源重组效率高，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于大片段DNA组装的基因工程酵母菌，其特征在于，所述基因工程酵母菌是以酿酒酵母为原始菌株经基因编辑得到；所述基因编辑包括如下任意一种：1)敲除Ku基因；2)敲除Ku基因并在敲除位点插入ScRad52
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M基因表达框；3)敲除Ku基因并过表达ScRad52基因。2.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述酿酒酵母包括但不限于酿酒酵母BY4741；所述Ku基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述ScRad52
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M基因表达框包含GAP启动子、ScRad52
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M基因和ADH1终止子；所述GAP启动子、ScRad52
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M基因、ADH1终止子及ScRad52
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M基因表达框的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1所述的基因工程酵母菌，其特征在于，所述过表达ScRad52基因具体为：在所述酿酒酵母基因组ScRad52基因前插入GAP启动子；所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.权利要求1所述基因工程酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：以酿酒酵母为原始菌株，通过CRISPR/Cas9系统敲除基因组上的Ku基因，得到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1；在基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将ScRad52
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M基因表达框整合到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1中的敲除位点，得到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc2；在基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1的基础上，通过CRISPR/Cas9系统将GAP启动子整合到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1中ScRad52基因前，得到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc3。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，通过如下步骤敲除基因组上的Ku基因：分别构建pUC57
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Donor
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ku70质粒和pCas9
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sgRNA
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ku70质粒，将从pUC57
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Donor
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ku70质粒中回收得到的Donor
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ku70线性DNA片段和pCas9
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sgRNA
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ku70质粒共同转化至酿酒酵母BY4741，经离心、孵育、培养后进行PCR筛选克隆，即可得到基因工程酵母菌株Synbio
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Sc1。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述pUC57
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Donor
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ku70质粒是由Donor
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ku70基因片段组装至pUC57
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Kan载体上所得；所述Donor
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ku70基因片段的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示；所述pCas9
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sgRNA
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ku70质粒是由sgRNA

【专利技术属性】
技术研发人员：徐杰，柳伟强，徐曾妮，李美美，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：