一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法技术

本专利公开一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法，该方法设计了一种功能发夹H1，能够识别目标物形成杂交双链以及在发夹H1末端设计了银纳米簇的合成模板，Ag

【技术实现步骤摘要】
一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法


[0001]本专利技术涉及银纳米簇原位合成的
，更具体地说是一种利用功能发夹DNA实现银纳米簇原位合成的方法。

技术介绍

[0002]miRNA在生物体基因表达过程中作为调控因子发挥着重要的作用。通过设计发夹DNA与目标miRNA实现特异性结合，并对其进行扩增循环，发夹DNA的末端是银纳米簇的合成稳定模板，原位合成荧光银纳米簇，进而实现了目标miRNA的无标记荧光检测。
[0003]但是，传统的miRNA扩增方法（如PCR）通常需要昂贵精密的仪器来实现miRNA的扩增循环。然而这些条件在资源受限的环境中往往难以获得，使得miRNA的检测在资源受限环境中的应用性大大降低。
[0004]为了解决miRNA检测在资源受限环境中应用受阻的问题，我们需要开发一种能简单快速完成miRNA检测的方法。相较于传统的miRNA检测方法，依赖于功能发夹DNA原位合成银纳米簇实现目标miRNA无标记检测的方法具有操作简捷、快速灵敏、成本低廉等特点。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是建立一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法。
[0006]一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法，其特征是包括以下步骤：1.1 主要溶液的配制：6 mM AgNO3溶液：取0.051 g硝酸银，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4
º
C环境避光保存备用； 6 mM NaBH4溶液：取0.011 g硼氢化钠，用灭菌水溶解，定容于50 mL容量瓶中，于4
º
C环境保存避光备用；20 mM PBS缓冲液：取3.58 g十二水磷酸氢二钠，取1.56 g二水磷酸二氢钠，0.107 g四水乙酸镁，用灭菌水溶解，调节pH至7.0，加水定容于500 mL，常温下保存备用；1.2 探针设计首先，根据目标物序列设计了能与目标物进行相互识别的功能发夹H1，形成杂交链（miRNA
‑
H1），H1的末端含有银纳米簇合成模板片段，其次，设计了发夹H2，发夹H2末端含有富G辅助序列，使用前将发夹H1、H2探针在95℃加热5 min，将其冷却至室温恢复成发夹结构以备实验使用；1.3 银纳米簇合成首先，将1
‑
100 μM 的发夹H1 10 μL，将新鲜配置的6 mM AgNCs母液稀释至600 μM，取 10 μL和70 μL的20 mMPBS缓冲液（PH 7.0）混合，在4℃下反应1 h，使Ag
+
与发夹H1末端的模板序列部分在Ag
+
与碱基之间的强相互作用下紧密结合；然后，将600 μM新鲜配置的6 mM NaBH4母液稀释至600 μM，取10 μL迅速加入混合物中，剧烈震荡60 s，并在4℃中避光反应6 h，使Ag
+
还原成Ag,并生成弱发荧光的银纳米簇（H1
‑
AgNCs），不使用时，在4℃下避光保存；
1.4 催化发夹自组装反应取10 μL上述制备好的H1
‑
AgNCs，向其中加入1 μL的目标物和1 μL 发夹H2（1
‑
100 μM），在室温下剧烈震荡60 s，然后加入88 μL PBS缓冲液（pH 7.0），反应混合物的终体积为100 μL ，并在30℃下孵育2.5 h，生成银纳米簇（H2
‑
H1/AgNCs）；1.5 银纳米簇协助的无标记荧光检测对上述制备的银纳米簇（H2
‑
H1/AgNCs）进行荧光光谱测量；
[0007]本专利技术的有益效果（1）利用功能发夹H1识别目标物并原位合成银纳米簇，在发夹H2的辅助作用下，实现目标物循环扩增与荧光信号实时定量的无标记检测；（2）相比于传统的荧光信号输出方法，避免了繁琐的修饰，节约了实验成本。
附图说明
[0008]图1为本文所述银纳米簇原位合成的原理图。
具体实施方式
[0009]为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容。
[0010]实施例1一种银纳米簇协助的miRNA无标记检测的方法，其特征是包括以下步骤：1.1 主要溶液的配制：6 mM AgNO3溶液：取0.051 g硝酸银，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4
º
C环境避光保存备用； 6 mM NaBH4溶液：取0.011 g硼氢化钠，用灭菌水溶解，定容于50 mL容量瓶中，于4
º
C环境保存避光备用；20 mM PBS缓冲液：取3.58 g十二水磷酸氢二钠，取1.56 g二水磷酸二氢钠，0.107 g四水乙酸镁，用灭菌水溶解，调节pH至7.0，加水定容于500 mL，常温下保存备用；1.2 探针设计首先，根据目标物序列设计了能与目标物进行相互识别的功能发夹H1，形成杂交链（miRNA
‑
H1），H1的末端含有银纳米簇合成模板片段，其次，设计了发夹H2，发夹H2末端含有富G辅助序列，在置换杂交链上的miRNA的同时，发夹H2的末端靠近银纳米簇，使用前将发夹H1、H2探针在95℃加热5 min，将其冷却至室温恢复成发夹结构以备实验使用；1.3 银纳米簇合成首先，将100 μM 的发夹H1 10 μL，将新鲜配置的6 mM AgNCs母液稀释至600 μM，取 10 μL和70 μL的20 mMPBS缓冲液（PH 7.0）混合，在4℃下反应1 h， 使Ag
+
与发夹H1末端的模板序列部分在Ag
+
与碱基之间的强相互作用下紧密结合；然后，将600 μM新鲜配置的6 mM NaBH4母液稀释至600 μM，取10 μL迅速加入混合物中，剧烈震荡60 s，并在4℃中避光反应6 h，使Ag
+
还原成Ag,并生成弱发荧光的银纳米簇（H1
‑
AgNCs），不使用时，在4℃下避光保存；1.4 催化发夹自组装反应取10 μL上述制备好的H1
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AgNCs，向其中加入1 μL的目标物和1 μL 发夹H2（100 μM），在室温下剧烈震荡60 s，然后加入88 μL PBS缓冲液（pH 7.0），反应混合物的终体积为100 μL ，并在30℃下孵育2.5 h，生成银纳米簇（H2
‑
H1/AgNCs）；
1.5 银纳米簇协助的无标记荧光检测对上述制备的银纳米簇（H2
‑
H1/AgNCs）进行荧光光谱测量。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于催化发夹自组装的银纳米簇原位合成方法，其特征是包括以下步骤：1.1 主要溶液的配制：6 mM AgNO3溶液：取0.051 g硝酸银，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4
º
C环境避光保存备用； 6 mM NaBH4溶液：取0.011 g硼氢化钠，用灭菌水溶解，定容于50 mL容量瓶中，于4
º
C环境保存避光备用；20 mM PBS缓冲液：取3.58 g十二水磷酸氢二钠，取1.56 g二水磷酸二氢钠，0.107 g四水乙酸镁，用灭菌水溶解，调节pH至7.0，加水定容于500 mL，常温下保存备用；1.2 探针设计首先，根据目标物序列设计了能与目标物进行相互识别的功能发夹H1，形成杂交链（miRNA
‑
H1），H1的末端含有银纳米簇合成模板片段，其次，设计了发夹H2，发夹H2末端含有富G辅助序列，具有识别功能的H1的序列为TAGGGGTAATATCCCATACCCCTATCACGCCCATATTCCCC；具有识别功能的H2的序列为GGGTGGGGTATGGGGTGGGGCGTGATAGCCCATACCCATATTA。1.3 银纳米簇合成首先，将100 μM 的发夹H1 10 μL，将新鲜配置的6 mM AgNCs母液稀释至600 μM，取 10 μL和70 μL的20 m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海云，李敬文，任娜，吴庭帆，隋渤仁，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：