本发明专利技术涉及分子标记技术领域，特别涉及一种钝缀锦蛤SSR引物组及其应用，本发明专利技术以钝缀锦蛤为材料，对钝缀锦蛤的全基因组信息进行测序，并利用MISA搜索SSR位点，分析SSR的分布特征，设计相应的SSR的引物，通过验证，该引物的等位基因数目和多态信息指数远高于现有技术开发的钝缀锦蛤SSR引物，具有多态性好，特异性高，有效区分参试样本的特点，同时，本申请利用该引物组进行聚类分析、绘制DNA指纹图谱都能取得良好的效果，能为今后钝缀锦蛤开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的基因位点和鉴定引物。等研究提供新的基因位点和鉴定引物。等研究提供新的基因位点和鉴定引物。
【技术实现步骤摘要】
一种钝缀锦蛤SSR引物组及其应用
[0001]本专利技术涉及分子标记
，特别涉及一种钝缀锦蛤SSR引物组及其应用。
技术介绍
[0002]钝缀锦蛤(LutrariasieboldiiReeve)俗称“沙包螺、天鹅蛋”，是隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veneridae)的一种经济价值较高、养殖前景较好的海洋贝类。钝缀锦蛤主要分布在西南太平洋，目前在中国的东海、南海海域及中国台湾岛沿岸常见，其中广西、广东和海南沿海区域拥有一定数量的钝缀锦蛤野生群体。钝缀锦蛤喜栖息于潮间带、低潮区、潮下带及浅海底质表层3～15cm的沙泥中。由于钝缀锦蛤肌肉发达，出肉率高，肉鲜味美，因此被人们当作主要食用的海鲜产品之一。目前国内外对钝缀锦蛤的报道主要集中在生态习性、养殖生态等研究，而对钝缀锦蛤遗传多样性评价及相关分子标记的研究尚未见报道。
[0003]动物遗传资源是一种服务人类发展需求的重要资源。遗传多样性分析是对遗传资源评价的一种重要方式；SSR是遗传多样性分析的最常用工具。利用SSR分析斑马鱼、鲶鱼、团头鲂、鲮鱼等鱼类的遗传多样性，为其基因组学研究提供基础。微卫星(SimpleSequenceRepeat，SSR)分子标记是一种最常用的分子标记，呈共显性遗传，且具有多态性高、重复性好、操作简便和结构稳定等优点，故在物种遗传多样性分析中广泛应用。微卫星标记因其等位基因丰富、共显性高、基因组中分布广泛，易于获得及试验方法简便的特点，成为当今动植物遗传分析的最常用方法。SSR可广泛应用于检测水产动物品种鉴定、遗传多样性分析、遗传连锁图谱和DNA指纹图谱构建等研究。随着贝类的基因和基因组测序数据不断增加和开放，增加了SSR标记开发能力。本研究拟利用项目组已完成钝缀锦蛤基因组数据进行微卫星分子标记的开发和初步试验，构建钝缀锦蛤DNA指纹图谱，为钝缀锦蛤品种鉴定和分子育种提供实用标记。
技术实现思路
[0004]鉴于上述内容，有必要提供一种钝缀锦蛤SSR引物组及其应用，该引物能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
[0005]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0006]一种钝缀锦蛤SSR分子标记引物组，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～52所示。
[0007]本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于钝缀锦蛤的聚类分析。
[0008]本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于不同钝缀锦蛤品种遗传多样性。
[0009]本申请还提供一种所述钝缀锦蛤SSR分子标记引物组在绘制不同钝缀锦蛤品种DNA指纹图谱上的应用。
[0010]本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行钝缀锦蛤聚类分析的方法，所述方法包括如下步骤：
[0011](1)钝缀锦蛤基因组的提取：对钝缀锦蛤的基因组DNA进行提取，并稀释成20ng
·
μL
‑1,置于
‑
20℃冰箱保存备用；
[0012](2)设计样品钝缀锦蛤的SSR引物：对步骤(1)的DNA进行测序，测序完成后利用MicroSAtellite(MISA，http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对全基因组进行SSR位点的鉴定；筛选标准:单核苷酸重复次数大于等于20次，双核苷酸重复的次数大于等于10次，三核苷酸重复的次数大于等于7次，四至六核苷酸重复的次数大于等于5次。将两个SSR位点间隔小于等于100nt视为一个复合的SSR位点。利用Primer3设计SSR引物，从中随机选取100对引物进行合成，用于后续试验；
[0013](3)对步骤(2)的SSR引物进行检测，得出100对SSR引物组；
[0014](4)钝缀锦蛤群体扩增：用步骤(3)的引物组中38对高多态引物对样本钝缀锦蛤群体20个体进行统计分析；估算不同地域品种来源的钝缀锦蛤其等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和PIC值，同时，计算出遗传距离；对钝缀锦蛤进行聚类分析。
[0015]进一步的，其特征在于，所述步骤(4)的PCR扩增反应体系为10μL，其组分为：1.0μL的模板DNA、各0.2μL的上下游引物(10μmol/L)、5μL的2
×
TSINGKEMasterMix、最后加入3.6μL的ddH2O补足10μL。
[0016]进一步的，其特征在于，所述步骤(4)的PCR扩增反应程序为：95℃预变性4min后；95℃变性45s，Tm(参见表6)退火45s，72℃延伸45s，共27个循环；72℃再延伸7min，终止温度为4℃，且4℃保存。PCR扩增后的产物利用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳
‑
银染法进行检测，读取条带。
[0017]本专利技术具有如下有益效果：
[0018]本专利技术以钝缀锦蛤为材料，对钝缀锦蛤的全基因组信息进行测序，并利用MISA搜索SSR位点，分析SSR的分布特征，设计相应的SSR的引物，通过验证，该引物的等位基因数目和多态信息指数远高于现有技术开发的钝缀锦蛤SSR引物，具有多态性好，特异性高，有效区分参试样本的特点，同时，本申请利用该引物组进行聚类分析、绘制DNA指纹图谱都能取得良好的效果，能为今后钝缀锦蛤开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的基因位点和鉴定引物。
【附图说明】
[0019]图1是基于各种核苷酸重复单元不同类型的微卫星分布图；
[0020]图2是基于SSR标记构建的20个钝缀锦蛤品种聚类树状图；
[0021]图3是6组不同引物组合构建参试样本的指纹图谱。
【具体实施方式】
[0022]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不
违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。
[0023]实施例：
[0024]一、实验材料：
[0025]本研究取自于广西北海20个钝缀锦蛤肌肉组织，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)参照说明书提取DNA，测其浓度，
–
20℃保存备用。
[0026]二、实验方法：
[0027]1、全基因组SSR位点的鉴定：
[0028]根据钝缀锦蛤全基因组数据，本文利用MicroSAtellite(MISA，http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对全基因组进行SSR位点的鉴定。筛选标准:单核苷酸重复次数大于等于本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种钝缀锦蛤SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组的序列如SEQ IDNO.1～52所示。2.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于钝缀锦蛤的聚类分析。3....
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏良，杨家林，韩春丽，杨果豪，朱鹏，劳东庆，
申请(专利权)人：北部湾大学，
类型：发明
国别省市：
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