特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽及其应用。本发明专利技术具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示的SP多肽及其编码核苷酸。本发明专利技术基于噬菌体展示技术，采用负筛正筛相结合的策略，通过负筛，得到不与肺癌细胞结合的噬菌体库，通过正筛，得到与肿瘤干细胞特异性结合的噬菌体克隆。本发明专利技术筛选得到的非小细胞肺癌肿瘤干细胞特异性SP多肽分子量小、活性高、穿透力强、特异性高，可以形成载药系统和治疗药物偶联结合，靶向治疗肺癌，还可用于荧光检测、监控非小细胞肺癌患者的病情进展和术后恢复情况或应用于针对非小细胞肺癌肿瘤的靶向药物筛选等。针对非小细胞肺癌肿瘤的靶向药物筛选等。

【技术实现步骤摘要】
特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质多肽
，具体涉及特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症数据显示，2020年全球癌症死亡病例996万例，其中肺癌死亡180万例，远超其他癌症类型，位居癌症死亡人数第一。2020年中国癌症死亡人数300万，肺癌死亡人数高达71万，占癌症死亡总数的23.8％。肺癌根据病理类型可分为两大类，分别是小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non
‑
small cell lung cancer，NSCLC)。其中，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80
‑
85％，包括大细胞肺癌、腺性肺癌和鳞状肺癌这三个主要的组织学亚型。众所周知，癌症患者往往死于癌症转移所造成的并发症，而不是原发肿瘤本身，目前肺癌的治疗方法包括手术切除、放疗和化疗、靶向和免疫治疗，虽然能够杀死大部分肿瘤细胞，但不能从根本上达到控制肿瘤的目的，很容易复发和转移，导致肺癌的5年生存率仍不足15％。究其根本，是由于不管是传统的化疗药物，还是分子靶向药物，主要作用于更成熟的肿瘤细胞而不是肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。肿瘤干细胞是存在于肿瘤细胞中为数极少却具有无限增殖能力并能自我更新的肿瘤细胞群体，在缺氧条件下可以诱导肿瘤血管生成和肿瘤转移，是肿瘤产生放化疗耐药的主要原因。只有杀死肿瘤干细胞或控制肿瘤干细胞的增殖后，肿瘤组织得不到补充，肿块变小或消失，才会达到根治肿瘤的目的。新的研究发现肺癌中存在肺癌干细胞，能抵抗放化疗，并在治疗结束后发生复发和转移。如何清除肺癌干细胞和避免耐药是肺癌治疗面临的挑战。因此，开发灵敏度高，特异性强的靶向肺癌干细胞的标志物，有利于阐明肿瘤的发生和发展机制，提供靶向治疗方案，从而更好的治愈肿瘤，对肺癌的治疗、诊断、复发转移和预后评价等过程具有重要的意义。
[0003]目前肿瘤干细胞分选的方法主要有以下两种：
[0004]一是基于干细胞表面标志物的分选，采用流式分选和磁珠分选技术，通过干细胞表面标志物对肿瘤干细胞进行分选。目前肿瘤干细胞标志物及分离鉴定方法大多借鉴正常干细胞的研究，其确切的表面标志物尚未确定。例如，目前公认的用于鉴定、分选乳腺癌肿瘤干细胞的表面标志物是CD44和ALDH1(乙醛脱氢酶1)。CD44是细胞表面的一种跨膜糖蛋白，它同调控细胞黏附、增殖、生长、转移的蛋白，与恶性肿瘤的发生、发展关系密切；乙醛脱氢(ALDH)是一系列细胞内酶的总称，与干细胞排毒、分化和耐药性密切相关。
[0005]二是利用细胞生物学特性进行的功能分选侧群细胞(Side Population SP)分选。自从1996年Goodell应用SP方法成功分离出造血干细胞以来，人们应用SP方法在多种肿瘤中分离出肿瘤干细胞。侧群细胞分选常用核酸染料Hoechst33342，其在紫外光激发下可发出蓝色波长450nm荧光。干细胞具有将Hoechst33342泵出细胞使细胞核不染色或者染色很淡的特性，根据这一特性，应用流式细胞仪将未被Hoechst33342染色的细胞与绝大部分肿
瘤细胞分离开来，这部分细胞称为侧群细胞。Maria等人应用侧群细胞分选法，成功的从肺癌细胞株和肺癌组织中分离出侧群细胞，证实其为肺癌肿瘤干细胞，并且细胞表达多种ABC转运蛋白，对化疗药物更为耐受。
[0006]基于干细胞表面标志物的分选方法比较片面，因为肿瘤干细胞的标志物往往不只一个，不表达CD44的细胞可能表达ALDH，可能是肿瘤干细胞，并且目前尚无明确的干细胞标志物。而侧群细胞分选是从功能上对干细胞和非干细胞进行区分，越原始的细胞必然外排异物的倾向和能力越强，因此侧群细胞分选理应比标志物分选更准确。
[0007]噬菌体展示技术(phage display technology，PDT)是1985年由Smith等人提出的，利用该技术直接对细胞进行筛选，从而得到特异性结合的多肽的方法已得到广泛的应用。其技术原理是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面，被展示的蛋白或多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。利用噬菌体展示技术筛选肺癌干细胞的特异性标志分子，一方面可以通过寻找对应的细胞表面受体，揭示多肽作用的信号通路，对肿瘤干细胞的基础研究具有重要意义；另一方面通过验证多肽对肿瘤干细胞的亲和性和特异性，将多肽和药物结合，从而可以更有效地靶向杀死肿瘤干细胞。

技术实现思路

[0008]本专利技术的一个目的是提供一组与人类非小细胞肺癌肿瘤干细胞特异性结合的多肽。
[0009]本专利技术首先提供了特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽，所述多肽为下述任一种：
[0010]A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽；
[0011]A2)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽；
[0012]A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；
[0013]A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的多肽衍生物。
[0014]所述多肽的名称为SP，其中氨基酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4的多肽的名称分别为SP2、SP4。
[0015]所述多肽为特异性靶向人类非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽，所述非小细胞肺癌肿瘤干细胞可为A549干细胞(A549 CSC)。
[0016]A3)所述标签如表1所示：
[0017]表1：标签的序列
[0018]标签残基序列Poly
‑
Arg5
‑
6(通常为5个)RRRRR
Poly
‑
His2
‑
10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep
‑
tag II8WSHPQFEKc
‑
myc10EQKLISEEDL
[0019]A4)所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。
[0020]上述A2)中的SP2、SP4多肽，分别为与SEQ ID No.2、SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多肽，其特征在于，所述多肽为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽；A2)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的多肽具有80％以上的同一性且特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的多肽；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；A4)在A1)或A2)的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的多肽衍生物。2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述C1)至C3)中的任一种：C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物。4.用于治疗肺癌的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的多肽和与权利要求1所述的多肽偶联或结合的肺癌治疗药物。5.特异性靶向非小细胞肺癌肿瘤干细胞的载药系统，其特征在于，所述载药系统包含权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，崔巍，吉祥，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：