东莨菪内酯的酶法制备方法技术

本发明专利技术涉及一种东莨菪内酯的酶法制备方法，具体包括先制备含有F6

【技术实现步骤摘要】
东莨菪内酯的酶法制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及东莨菪内酯的酶法制备方法。

技术介绍

[0002]东莨菪内酯，又称东莨菪素、莨菪酚、莨菪亭，化学名为7
‑
羟基
‑
6甲氧基香豆素，英文名为：scopoletin，属于香豆素类化合物中的一种，分子式为C
10
H8O4，相对分子质量为192.17，是植物体内一种重要的酚类抗毒素。东莨菪内酯广泛存在于多种药用植物、杂草和作物中，目前发现含有东莨菪内酯的植物超过110000种。东莨菪内酯已证实具有多种生物活性，临床上具有抗癌、抗炎、保肝、解痉挛的作用，同时也有研究表明东莨菪内酯可以通过降血压、调节血脂抑制主动脉收缩从而抗心血管疾病，对老年痴呆症也具有很好的治疗作用，还具有抗血小板凝聚、抗HIV和抗氧化等活性。
[0003]随着东莨菪内酯的活性不断被挖掘，市场的需求日益增大，东莨菪内酯的生产问题成为了研究的热点。然而，目前东莨菪内酯的获取主要通过从中药植物黄花蒿的组织中进行分离提取。然而东莨菪内酯在植物中的含量非常低下，传统的获取方式在提倡环境友好型社会发展的当下有着诸多的弊端。其次，植物中的多种东莨菪内酯类似物难以通过低成本和无公害的方式进行去除。化学合成现今面临反应时间长，高耗能、毒副产品及环境污染等难题未能解决。合成生物学的发展为诸多植物次生代谢产物的合成提供了可能。它主要是利用重组微生物工程菌株的发酵来实现，微生物菌株能简便地从实验室到工业化的大规模生产，且具有生产周期短、培养成本低、产物提纯简便和环境污染少等优势，相比起来，具有更广阔的应用前景。
[0004]近年来，利用基因工程技术改造大肠杆菌，使其生物合成东莨菪内酯的研究报道很少。Lin等
[1]在大肠杆菌中共表达酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia
‑
lyase，TAL)、大肠杆菌羟化酶(two
‑
component flavin
‑
dependent monoxygenase，HpaBC)、咖啡酰
‑
CoA
‑
O
‑
甲基转移酶(Caffeoyl
‑
CoA
‑3‑
O
‑
methyltransferase，CcoOMT)、4
‑
香豆酰
‑
CoA连接酶(4CL)和阿魏酰
‑
CoA
‑6’‑
羟化酶(Feruloyl
‑
CoA hydroxylase，F6
’
H)，实现了以葡萄糖和甘油为碳源生成31mg/L东莨菪内酯。Yang等
[2]将F6
’
H与GST标签蛋白融合后，增强了F6
’
H的稳定性和溶解性，以阿魏酸为底物生成了80mg/L东莨菪内酯。由此可以看出，微生物制备东莨菪内酯仍处于起步阶段，有许多问题有待解决，能完善和优化出一套东莨菪内酯合成制备体系，定将对东莨菪内酯的产业有重要的推动作用。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种合成效率高的东莨菪内酯的酶法制备方法。该方法可高产东莨菪内酯，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、东莨菪内酯的酶法制备方法，包括以下步骤：
[0008]A.制备含有F6
’
H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；
[0009]B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。
[0010]进一步，在本专利技术提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述F6
’
H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步，在本专利技术提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
[0012]进一步，在本专利技术提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为：
[0013](1)将人工合成F6
’
H1基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57
‑
F6
’
H1；设计包含Bam HI酶切位点的上游引物F6
‘
H1
‑
BamHI
‑
F和包含Eco RI酶切位点的下游引物F6
‘
H1
‑
EcoRI
‑
R，以pUC57
‑
F6
‘
H1为模板，PCR扩增含有双酶切位点的F6
‘
H1基因：ggatcc+F6
‘
H1+gaattc；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX
‑
6p
‑
1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；挑选含有F6
’
H1基因的阳性克隆；
[0014](2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57
‑
FCS；设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS
‑
EcoRI
‑
rbs
‑
F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS
‑
XhoI
‑
R，以pUC57
‑
FCS为模板，PCR扩增含有双酶切位点和核糖体结合位点的FCS基因片段：ggatcc+aaggagatatacca+FCS+ctcgag；同样分别经EcoRI和XhoI双酶切载体pGEX
‑
F6
’
H1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；最后得到含有F6
’
H1基因和FCS基因的重组基因工程菌。
[0015]进一步，在本专利技术提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述上游引物F6
‘
H1
‑
BamHI
‑
F的序列如SEQ ID NO.5所示；所述下游引物F6
‘
H1
‑
EcoRI
‑
R的序列如SEQ IDNO.6所示。
[0016]进一步，在本专利技术提供的东莨菪内酯的酶法制备方法中，所述上游引物FCS
‑
EcoRI
‑
rbs
‑
F的序列如SEQ ID NO.9所示；所述下游引物FCS
‑
XhoI
‑
R的序列如SEQ IDNO.10所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A.制备含有F6
’
H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。2.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，所述F6
’
H1基因的序列如SEQ ID NO.1所示,所述阿魏酰辅酶A合成酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A中制备重组基因工程菌的表达菌株为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的东莨菪内酯的酶法制备方法，其特征在于，步骤A重组基因工程菌的具体制备方法为：1)将人工合成F6
’
H1基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57
‑
F6
’
H1；设计包含Bam HI酶切位点的上游引物F6
‘
H1
‑
BamHI
‑
F和包含Eco RI酶切位点的下游引物F6
‘
H1
‑
EcoRI
‑
R，以pUC57
‑
F6
‘
H1为模板，PCR扩增含有双酶切位点的F6
‘
H1基因：ggatcc+F6
‘
H1+gaattc；同样分别经BamHI和EcoRI双酶切载体pGEX
‑
6p
‑
1；将上述目的片段和载体用T4连接酶进行连接；连接完毕后，转化到宿主细胞感受态中；挑选含有F6
’
H1基因的阳性克隆；2)将人工合成阿魏酰辅酶A合成酶基因构建至质粒pUC57，得到含有目的基因的质粒pUC57
‑
FCS；设计包含EcoRI酶切位点和核糖体结合位点rbs的上游引物FCS
‑
EcoRI
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rbs
‑
F和包含XhoI酶切位点的下游引物FCS
‑
XhoI
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：丁伟，郭富友，肖庆礼，杨亮，王建林，袁明，彭奎，周红，万凤琳，简渝凡，
申请(专利权)人：重庆中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：