血浆中阿扑吗啡的定量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆中阿扑吗啡的定量测定方法，属于阿扑吗啡定量检测方法技术领域，本方法首先制备阿扑吗啡的校正标样、质控样品、零浓度血浆样品；然后制备校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，以及空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液；再用空白血浆样品工作液、空白试剂样品和零浓度血浆样品工作液进行液相色谱

【技术实现步骤摘要】
血浆中阿扑吗啡的定量测定方法


[0001]本专利技术属于药物检测领域，特别是血浆中阿扑吗啡的定量测定方法。

技术介绍

[0002]阿扑吗啡是一种白色至淡灰色粉末的化学品，可用于抢救误食毒物及难以洗胃的患者；或用于治疗吸入石油蒸馏液(如煤油、汽油、煤焦油、燃料油或清洁液等)的患者，以防止严重的吸入性肺炎；也可用于治疗帕金森病，以及诊断和治疗帕金森病患者由于长期接受左旋多巴治疗而出现的严重的症状波动。
[0003]阿扑吗啡在舌下给药后快速吸收，给药后10min血浆中可测出阿扑吗啡，40
‑
60min达血药峰浓度，2
‑
4mg剂量的Cmax平均值为0.7ng/mL，个体间的变异在40％～70％。阿扑吗啡的药物剂量与Cmax和AUC 0
→
∞呈正相关，有明显的首过效应，舌下给药的生物利用度为16％～18％，而内服的生物利用度仅为1％～2％，因而吞服后几乎无效。阿扑吗啡通过舌下途径治疗勃起障碍时，Cmax仍较低，约4
‑
7ng/mL的消除半衰期很短，在24
‑
30min之间。低药理学剂量、血浆中获得的低浓度、较短的消除半衰期已经越来越需要进行药代动力学研究，特别是开发更方便的方法，是目前存在的具有挑战性的分析问题。
[0004]阿扑吗啡绝大部分转化成代谢物，和要的代谢为葡萄醛化结合物和硫酸结全物，及N
‑
脱甲基化生成的去甲基阿扑吗啡葡萄醛化结合的含量极少，去甲基阿扑吗啡无任何药理作用。
[0005]现有的技术文献中，阿扑吗啡的分析技术主要包括气相色谱检测、火焰电离检测、质谱检测，耗时样品制备和衍生，高效液相色谱(HPLC)结合紫外、荧光以及电化学检测。以上检测方法的检出限均≥0.5ng/mL的样品1mL。此外，阿扑吗啡还可以通过液质联用仪进行检测，虽然降低了检测限，但样品处理方法为固相萃取或液液萃取，只能检测少量样本，方法操作复杂，时间和原材料成本较高。
[0006]例如文献《液相色谱
‑
串联质谱法测定人血浆中阿扑吗啡》(郭继芬等，分析测试学报，2004年9月，第23卷增刊，39、43页)中公开了采用液相色谱
‑
串联质谱法测定人血浆中阿扑吗啡的方法，然而该文献中未使用稳定剂，明显不符合基本技术原理，因此其数据结果存在疑问；此外，所用的提取溶剂为乙醚，这种麻醉气体对操作环境和操作步骤有更严格的安全要求，例如需要在通风橱中进行等。
[0007]又例如文献《人血浆中纳美芬和阿扑吗啡测定方法的建立及应用》(李平，沈阳药科大学，2007年5月)中公开了人血浆中阿扑吗啡的测定方法，建立了灵敏、专属、快速的LC/MS/MS法，测定血浆中的阿扑吗啡，并用于低剂量制剂的临床药动学研究，然而该论文中在样品预处理时用到了有毒的稳定剂2
‑
巯基乙醇，因此也对操作环境和操作步骤有更严格的安全要求。

技术实现思路

[0008]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了血浆中阿扑吗啡浓度的测定方法，具体
通过以下技术实现，整个检测操作过程相对简便快捷，无毒环保，试剂容易购买，检测限低至0.02
‑
50ng/mL。
[0009]血浆中阿扑吗啡的定量测定方法，包括以下步骤：
[0010]S1、制备阿扑吗啡的校正标样、质控样品；
[0011]S2、取步骤S1制备的校正标样、质控样品、待测样品各80μL，零浓度血浆样品取80μL含0.18％抗坏血酸的空白血浆分别加至EP管中，所述校正标样、质控样品、待测样品的EP管中各自加入20μL内标工作液和400μL甲基叔丁基醚(MTBE)，涡旋混合；分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取300μL的上清液加至96孔板中，吹干，加入含有100μL复溶液进行复溶，涡旋混合5min，制成校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，待用；
[0012]S3、分别取80μL含0.18％抗坏血酸的空白血浆样品和80μL含0.3％抗坏血酸的甲醇溶液加至EP管中，并分别加入20μL含0.3％抗坏血酸的甲醇溶液和400μL的甲基叔丁基醚，涡旋混合，分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取300μL的上清液加至96孔板中，吹干，加入100μL复溶液复溶，涡旋混合5min，制成空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液，待用；
[0013]S4、以步骤S3制备的空白血浆样品工作液、空白试剂样品工作液和步骤S2制备的零浓度血浆样品工作液对液相色谱
‑
质谱系统进行测试；
[0014]S5、以步骤S2制备的校正标样工作液、质控样品工作液和待测样品工作液分别进行液相色谱
‑
质谱分析，建立阿扑吗啡标准曲线，计算得到待测样品工作液中阿扑吗啡的含量。
[0015]通过采用本专利技术提供的上述方法，对分析物和内标的色谱图采集和色谱峰积分由分析软件Analyst 1.6.3(AB Sciex)进行处理，在优化积分参数后，对目标色谱峰自动积分，不允许对色谱峰进行单独积分或手动积分。
[0016]分析物浓度计算方法为：用软件Analyst 1.6.3分别获得分析物与内标工作液中的甲苯磺丁脲的色谱峰面积，采用加权(W＝1/x2)最小二乘法以血浆中分析物浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归，所得的回归方程(Y＝a+bX)即为标准曲线。根据分析批的标准曲线计算血浆中分析物的浓度，浓度单位为ng/mL。
[0017]优选地，步骤S1中，阿扑吗啡的校正标样和质控样品的制备方法为：精密称取一定量的阿扑吗啡，重量经校正因子计算后，加入含有质量分数为0.3％的抗坏血酸的甲醇溶液，配制成浓度为1mg/mL的溶液；再用含有质量分数为0.3％的抗坏血酸且体积比为1:1的甲醇水溶液依次稀释成浓度为1000ng/mL、800ng/mL、500ng/mL、160ng/mL、40ng/mL、10ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.4ng/mL的校正标样储备液，以及浓度为600ng/mL、60ng/mL、3ng/mL的质控样品储备液；最后各取校正标样储备液和质控样品储备液10μL，加入190μL的含有质量分数为0.18％的抗坏血酸的空白血浆样品，得到校正标样和质控样品；
[0018]步骤S2的所述零浓度样品是由80μL含有质量分数为0.18％抗坏血酸的空白血浆样品、20μL内标工作液和400μL甲基叔丁基醚涡旋混合而成。
[0019]采用上述方法制得的校正标样的阿扑吗啡浓度为0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、8ng/mL、25ng/mL、40ng/mL、50ng/mL；制得的质控样品的阿扑吗啡浓度为0.15ng/mL、3ng/mL、30ng/mL。
[0020]优选地，步骤S2中，所述内标工作液是浓度为1000ng/mL甲苯磺丁脲溶液(采用0.3％的抗坏血酸的甲醇溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血浆中阿扑吗啡的定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备阿扑吗啡的校正标样、质控样品；S2、取步骤S1制备的校正标样、质控样品、待测样品各80μL，零浓度血浆样品取80μL含0.18％抗坏血酸的空白血浆分别加至EP管中，所述校正标样、质控样品、待测样品和零浓度血浆样品的EP管中各自加入20μL内标工作液和400μL甲基叔丁基醚，涡旋混合；分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取300μL的上清液加至96孔板中吹干，加入100μL复溶液进行复溶，涡旋混合5min，制成校正标样工作液、质控样品工作液、待测样品工作液、零浓度血浆样品工作液，待用；S3、分别取80μL含0.18％抗坏血酸的空白血浆样品和80μL含0.3％抗坏血酸的甲醇溶液加至EP管中，并分别加入20μL含0.3％抗坏血酸的甲醇溶液和400μL的甲基叔丁基醚，涡旋混合，分别在4℃，10000g条件下离心5min；各自取300μL的上清液加至96孔板中，吹干，加入100μL复溶液复溶，涡旋混合5min，制成空白血浆样品工作液和空白试剂样品工作液，待用；S4、以步骤S3制备的空白血浆样品工作液、空白试剂样品工作液和步骤S2制备的零浓度血浆样品工作液对液相色谱
‑
质谱系统进行测试；S5、以步骤S2制备的校正标样工作液、质控样品工作液和待测样品工作液分别进行液相色谱
‑
质谱分析，建立阿扑吗啡标准曲线，计算得到待测样品工作液中阿扑吗啡的含量。2.根据权利要求1所述的血浆中阿扑吗啡的定量测定方法，其特征在于，步骤S1中，阿扑吗啡的校正标样和质控样品的制备方法为：精密称取一定量的阿扑吗啡，重量经校正因子计算后，加入含有质量分数为0.3％的抗坏血酸的甲醇溶液，配制成浓度为1mg/mL的溶液；再用含有质量分数为0.3％的抗坏血酸且体积比为1:1的甲醇水溶液依次稀释成浓度为1000ng/mL、800ng/mL、500ng/mL、160ng/mL、40ng...

【专利技术属性】
技术研发人员：李盈，吴琳，郏自明，胡汉高，
申请(专利权)人：湖北省疾病预防控制中心湖北省预防医学科学院，
类型：发明
国别省市：