提高CAR-NK细胞阳性率的表达方法及LDL受体应用技术

本发明专利技术公开了一种提高CAR

【技术实现步骤摘要】
提高CAR
‑
NK细胞阳性率的表达方法及LDL受体应用


[0001]本专利技术涉及慢病毒转染、包装等
，尤其涉及一种LDL受体基因及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。其中，恶性肿瘤因易发生转移，治疗后易复发且在某些特殊的微环境下导致极难治愈。
[0003]原代NK细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致NK细胞对多种载体系统的摄取率低，NK细胞的转基因表达量低，只有病毒载体在原代NK细胞中实现了较高的基因转移效率。为了提高病毒载体的安全性，已经创建了表达系统，其中包膜蛋白在单独的质粒上表达。这允许在称为假型化的过程中安全生成具有外源包膜蛋白的修饰病毒颗粒。增强NK细胞转导的一种方法是选择最佳假型包膜蛋白。常用的水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G通常非常有效，因为它与存在于多种细胞中的LDL受体结合。然而，它对淋巴细胞的感染效率低下，并且由于NK细胞表面L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高CAR
‑
NK细胞阳性率的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：NK细胞激活并瞬时过表达LDL受体；对过表达LDL受体的NK细胞进行慢病毒侵染。2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述NK细胞激活并瞬时过表达LDL受体步骤中，还包括如下步骤：从外周血中获取NK细胞，并按照5.0
×
105个细胞/孔的密度接种至24孔板中，并往24孔板中加入培养基进行NK细胞培养；NK细胞培养16～18小时后，去除培养基，更换无血清培养基，孵育1小时；将质粒转染混合液加入24孔板中，对NK细胞进行瞬时转染处理；转染6小时后，去除24孔板中的混合液，更换完全培养基；转染48小时后，收集上清NK细胞悬浮液，此时NK细胞激活并瞬时过表达LDL受体。3.根据权利要求2所述的表达方法，其特征在于，NK细胞无血清培养时，每5.0
×
105个细胞加入200～500μl无血清培养基。4.根据权利要求2所述的表达方法，其特征在于，所述质粒转染混合液包括四质粒、Lipo 3000和OPTI
‑
MEM，且LIPO3000与四质粒总数按2:1(v/m)，OPTI
‑
MEM为100～300ul。5.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述对过表达LDL受体的NK细胞进行慢病毒侵染步骤中，还包括如下步骤：往激活后的瞬转过表达LDL受体的NK细胞悬液中加入转染助转剂，获得NK细胞转染悬液；往NK细胞转染悬液中加入慢病毒，进行慢病毒转染；慢病毒转染完成后，加入完全培养基，对慢病毒转染的NK细胞进行培养；随后收集细胞悬液，备用。6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述转染助转剂为Polybrene助转剂或碱性氨基酸的无血清培养基；且每1ml NK细胞悬液添加2μl～20μl的转染助转剂。7.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，慢病毒转染步骤中，所述慢病毒的加入量为MOI＝1～20，且转染时间为6～24小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海涛，马丽雅，都晓龙，
申请(专利权)人：深圳市先康达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：