一种以烟酸为原料生物合成双(3-吡啶基甲基)胺的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种以烟酸为原料生物合成双(3

【技术实现步骤摘要】
一种以烟酸为原料生物合成双(3
‑
吡啶基甲基)胺的方法与应用


[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种以烟酸为原料生物合成双(3
‑
吡啶基甲基)胺的方法与应用。

技术介绍

[0002]仲胺是天然产品、药物分子和工业材料合成的关键中间体。仲胺及其衍生物是合成各种含氮化合物非常重要的前体。目前合成仲胺的方法几乎都是化学合成法，通常是通过昂贵的催化剂催化的硝基化合物和醛之间的缩合反应而产生的(Chen C,Fan R,Han M,et al.Tunable synthesis of imines and secondary
‑
amines from tandem hydrogenation
‑
coupling of aromatic nitro and aldehyde over NiCo5 bi
‑
metallic catalyst[J].Applied Catalysis B:Environmental,2021,280:119448.)。或者，通过氧化和缩合反应实现的醇和初级胺的耦合，可以在不同的异质催化剂上合成相应的仲胺化学物质(Wang J,Ye S,Liu X,et al.Hydrazine as Facile Nitrogen Source for Direct Synthesis of Amines over a Supported Pt Catalyst[J].ACS Sustainable Chemistry&Engineering,2020,8(43):16283
‑
16295.)。化学合成法存在多种弊端，如Cu等金属对环境污染严重，且钯、钌等贵金属价格昂贵，还有需要高温条件等，导致产品质量跟不上医药产业的发展。以微生物发酵法生产仲胺具有绿色、安全、低成本等优势，已成为仲胺合成的发展趋势。然而关于生物合成仲胺的文献报导很少。Lorna J.Hepworth等人曾以酮酸为底物，通过含羧酸还原酶、转氨酶和亚胺还原酶的全细胞催化生成手性环状仲胺。但是该文献不适合合成含吡啶或苯环的线型仲胺，所以需要探索一条生物合成含吡啶环或苯环的线型仲胺的新途径。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种以烟酸为原料生物合成双(3
‑
甲基吡啶)胺的方法。
[0004]本专利技术提供了一种以烟酸为原料生物合成双(3
‑
吡啶基甲基)胺的方法，方法如下：
[0005](1)制备基因工程菌1：出发菌为大肠杆菌K
‑
12MG1655 RARE，过表达羧酸还原酶基因nccar、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase、ω
‑
转氨酶基因oata获得基因工程菌1；
[0006](2)制备基因工程菌2：出发菌为大肠杆菌K
‑
12MG1655 RARE，过表达亚胺还原酶基因ired361，获得基因工程菌2；
[0007](3)将步骤(1)获得的基因工程菌1以烟酸为底物进行发酵获得上清液；
[0008](4)将步骤(2)获得基因工程菌2加入到步骤(3)获得的上清液中，加入烟醛进行发酵，获得双(3
‑
吡啶基甲基)胺。
[0009]进一步地限定，所述K
‑
12MG1655 RARE是将大肠杆菌K
‑
12MG1655中敲除了3个醛酮还原酶基因和3个醇脱氢酶基因。
[0010]进一步地限定，所述醛酮还原酶基因为dkgB基因、yeaE基因和dkgA基因；所述醇脱氢酶基因为yqhD基因、yahK基因和yjgB基因。
[0011]进一步地限定，所述羧酸还原酶基因nccar的GeneBank ID为XM_950727.2；所述磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase的GeneBank ID为CP024090.1；所述ω
‑
转氨酶基因oata的GeneBank ID为CP000758.1；所述亚胺还原酶基因ired361的基因序列为SEQ ID NO.3。
[0012]进一步地限定，步骤(3)中发酵体系为：烟酸、葡萄糖、MgSO4和L
‑
Ala。
[0013]进一步地限定，所述发酵体系为：所述发酵体系为：5mM烟酸、8％葡萄糖、10mM MgSO4、20mM L
‑
Ala。
[0014]进一步地限定，步骤(4)中烟醛的浓度为5mM。
[0015]进一步地限定，步骤(3)的发酵条件为：30℃，200rpm反应2h。
[0016]进一步地限定，步骤(4)发酵条件为30℃，pH＝7.0，发酵持续1
‑
5.5小时。
[0017]本专利技术提供上述的方法在提高双(3
‑
吡啶基甲基)胺产量中的应用。
[0018]有益效果：验证了ired361对3
‑
吡啶甲醛和3
‑
吡啶甲胺缩合产物的活性，双(3
‑
甲基吡啶)胺，含量约50ppm，50ppm＝50mg/L。构建了以烟酸为底物的双(3
‑
吡啶基甲基)胺的新生物合成途径，使该仲胺的生成更温和无污，为其他含吡啶环或苯环的线型仲胺的合成提供新思路。
附图说明
[0019]图1为pET28a
‑
nccar
‑
pptase重组质粒结构示意图；
[0020]图2为pEACYCDuet
‑
oata重组质粒结构示意图；
[0021]图3为pET28a
‑
ired361重组质粒结构示意图。
具体实施方式
[0022]下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。所用内切酶均购自NEW England，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，PBS缓冲液粉末购买自诺唯赞生物科技股份有限公司，感受态均购自全式金生物科技有限公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
[0023]溶液配方：
[0024]LB液体培养基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，接种时补加相应抗生素。
[0025]200mM的丙氨酸：89
×
200mM
÷
1000
÷
100＝0.198g/10mL，即称取0.198g氨基供体，溶于10mL PBS缓冲液中。
[0026]50mM烟酸：123
×
50mM
÷
1000
÷
100＝0.0615g/10mL，即称取0.0615g烟酸，溶于10mL PBS缓冲液中。
[0027]8％葡萄糖：8g葡萄糖加ddH2O，定容到100ml。
[0028]实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以烟酸为原料生物合成双(3
‑
吡啶基甲基)胺的方法，其特征在于，方法如下：(1)制备基因工程菌1：出发菌为大肠杆菌K
‑
12MG1655 RARE，过表达羧酸还原酶基因nccar、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase、ω
‑
转氨酶基因oata获得基因工程菌1；(2)制备基因工程菌2：出发菌为大肠杆菌K
‑
12MG1655 RARE，过表达亚胺还原酶基因ired361，获得基因工程菌2；(3)将步骤(1)获得的基因工程菌1以烟酸为底物进行发酵获得上清液；(4)将步骤(2)获得基因工程菌2加入到步骤(3)获得的上清液中，加入烟醛进行发酵，获得双(3
‑
吡啶基甲基)胺。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述K
‑
12MG1655 RARE是将大肠杆菌K
‑
12MG1655中敲除了3个醛酮还原酶基因和3个醇脱氢酶基因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述醛酮还原酶基因为dkgB基因、yeaE基因和dkgA基因；所述醇脱氢酶基因为yqhD基因、yahK基因和yjgB基因。4.根据权利要求1所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炜，冯埃生，
申请(专利权)人：广东腐蚀科学与技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：