【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及生物矿化，具体涉及一种高活性脲酶结构基因及其表达和应用。
技术介绍
1、混凝土是目前用量最大且最广的建筑材料，但其使用过程中由于内外因素作用下会产生不可避免的裂缝，如早期温度影响开裂、收缩导致产生裂纹以及后期的荷载裂缝等。裂缝的存在会导致建筑部件或整体上出现不稳定以及耐久性下降，而生物矿化材料是一种环境友好的、材料相容性强的、耐久度较高的新型粘合剂，能够应用于建筑工程与文物修复等环境，其中微生物修复材料相对高效且低毒，具有良好的应用前景。
2、微生物矿化技术是利用微生物将自然界的化学物质转化为矿物沉淀的方法，其应用大多数采用脲酶类型细菌，如巴氏芽孢杆菌(bacillus pasteurii或称为巴氏芽孢八叠球菌sporosarcina pasteurii)，该微生物是当前已知生物矿化能力最强、分解尿素效率较高的矿化菌株，其脲酶是目前已知微生物脲酶中活性最高的。该脲酶基因能够编码脱辅基蛋白urea、ureb、urec以及辅助蛋白ured、uree、uref、ureg，其中各种辅助蛋白能够促进脲酶中镍活性中心的组装，而具有活性的holo-ure(abc)3能够水解尿素生成碳酸氢根离子或碳酸根离子，进一步与钙离子等游离金属阳离子结合生成具有胶结性质的生物矿化沉淀。
3、微生物所产的碳酸钙沉淀往往不是单一的碳酸钙粉末，实际上是一种含有碳酸钙的生物粘合材料，更适合应用于固化土壤及文物修复等需要加强粘合效果的环境。现有的技术中采用巴氏芽孢杆菌直接作为生物矿化的原料，利用其脲酶以及形成细菌孢子的
技术实现思路
1、针对现有技术中微生物诱导碳酸钙沉淀应用中脲酶活性较低的问题，本专利技术的目的在于提出一种高活性脲酶结构基因及其表达和应用，通过对脲酶基因进行改造，增强其水解尿素活性。
2、为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术第一方面在于提供一种高活性脲酶结构基因，核苷酸序列如seq id no.1所示；
4、需要说明的是，含有本专利技术提供的脲酶结构基因的表达载体或克隆载体均属于本专利技术要求保护的范围。
5、本专利技术第二方面在于提供一种包含高活性脲酶结构基因的重组载体。
6、在一些实施方式中，载体为prs426质粒。
7、本专利技术第三方面在于提供一种包含高活性脲酶结构基因的转化体。
8、在一些实施方式中，宿主细胞为e.coli bl21(de3)。
9、本专利技术第四个方面在于提供一种包含高活性脲酶结构基因的重组脲酶菌。
10、本专利技术第五方面在于提供一种构建重组脲酶菌的方法，包括以下步骤：
11、将高活性脲酶结构基因克隆到prs426质粒中，构建重组质粒prs426-ureabcefgd-mut；
12、将重组质粒prs426-ureabcefgd-mut转化e.coli bl21(de3)，得重组脲酶菌。
13、本专利技术第六方面在于提供一种制备高活性脲酶的方法，将重组脲酶菌接种于lb液体培养基中，培养至od600＝0.6-0.8时加入终浓度为1mm的iptg进行诱导培养，在od600＝2.0-2.2时收菌。
14、在一些实施方式中，lb液体培养基含有50μm nicl2与100μg/ml amp。
15、本专利技术第七方面在于提供重组脲酶菌在生物矿化中的应用。
16、本专利技术具体步骤为：
17、(1)选取巴氏芽孢杆菌来源的脲酶基因genbank:x78411.1，其脲酶序列号为ec3.5.1.5，将该目标基因片段亚克隆到prs426质粒，构建载体prs426-ureabcefgd，对prs426-ureabcefgd中ured基因进行定点突变改造，突变基因如seq id no.1所示，构建得到prs426-ureabcefgd-mut；
18、(2)取质粒冻干粉prs426-ureabcefgd-mut溶于双蒸水得到质粒溶液，取质粒溶液导入感受态细胞e.coli bl21(de3)中，冰浴后通过水浴完成热激反应，随即冰浴，加入无抗lb培养基，于金属浴振荡培养，经离心机离心，留上清液重悬，并涂至lb固体培养基中，倒置培养过夜得到单菌落，取单菌落于对应抗性lb液体培养基中活化培养，获得重组脲酶菌e.coli bl21(de3)/prs426-ureabcefgd-mut；
19、(3)将重组脲酶菌转接至lb液体培养基中，摇床培养；直至od600＝0.6～0.8时加入终浓度为1mm的iptg进行诱导培养，摇床培养后在od600＝2.0～2.2时收菌，获得过表达脲酶的mut菌液。
20、本专利技术包含以下有益效果：
21、本专利技术通过对巴氏芽孢杆菌来源的脲酶基因(genbank:x78411.1，脲酶序列号为ec 3.5.1.5)中的ured基因进行定点突变改造，获得核苷酸序列如seq id no.1所示的高活性脲酶结构基因，然后将大肠杆菌作为底盘细胞，异源表达该高活性脲酶结构基因，获得能够产生具有高效水解尿素活性的脲酶蛋白的重组脲酶菌，并将其应用于生物矿化。
22、本申请提供的重组脲酶菌的脲酶活性比原始菌株增强约1.2倍，能有效提高大肠杆菌水解尿素的能力，有效解决微生物诱导碳酸钙沉淀应用中脲酶活性较低的问题。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高活性脲酶结构基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种包含权利要求1所述的高活性脲酶结构基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，载体为pRS426质粒。
4.一种包含权利要求1所述的高活性脲酶结构基因的转化体。
5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
6.一种包含权利要求1所述的高活性脲酶结构基因的重组脲酶菌。
7.一种构建权利要求6所述的重组脲酶菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.一种制备高活性脲酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基含有50μM NiCl2与100μg/mL Amp。
10.权利要6所述重组脲酶菌在生物矿化中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种高活性脲酶结构基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.1所示。
2.一种包含权利要求1所述的高活性脲酶结构基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，载体为prs426质粒。
4.一种包含权利要求1所述的高活性脲酶结构基因的转化体。
5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，宿主细胞为e.coli bl21(de3)。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘炜，
申请(专利权)人：广东腐蚀科学与技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：
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