【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及bna-mir393基因在调控甘蓝型油菜种子细胞形态中的应用，属于甘蓝型油菜基因工程领域。
技术介绍
1、甘蓝型油菜(brassica napus l.)是我国主要的油菜栽培种类，具有高产、抗逆性强、适应性广等特点。鉴于甘蓝型油菜的经济价值以植物油和蛋白利用为主，种子的品质和产量性状是基础研究和育种改良所关注的重要性状，而细胞形态发生是影响种子发育的关键因素。
2、mirna是一类广泛存在的、长度为20～24nt的内源性srna分子。研究表明mirna可降解靶mrna或抑制靶mrna翻译，从而介导基因转录后水平的调控(xie m,zhang s,yub.microrna biogenesis,degradation and activity in plants.cell mol life sci,2015,72:87-99)；mirna也可通过介导dna甲基化和组蛋白修饰等方式调控靶基因的表达(khraiwesh b,arif ma,seumel gi,et al.transcriptional control of geneexpression by micrornas.cell,2010,140:111-122)。植物mirna的靶基因主要编码转录因子(tf)，而tf在植物的生长发育、形态发生等过程中均发挥了重要作用。mir393是植物中较为保守的mirna家族，其靶基因编码的生长素受体蛋白参与生长素信号感知和aux/iaa蛋白降解，而aux/iaa蛋白可以通过与arf等互作抑制生长素相关基因表达，
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供bna-mir393基因在调控甘蓝型油菜种子细胞形态中的应用，本专利技术的第二目的是提供一种改变甘蓝型油菜种子细胞形态的转基因植物的培育方法，本专利技术的第三目的是提供一种该培育方法得到的转基因植物。具体涉及通过功能验证得到一种能够影响种子细胞形态发育的甘蓝型油菜bna-mir393在油菜品质和产量性状育种改良中的应用。采用rt-pcr的方法，分离到包含甘蓝型油菜bna-mir393前体序列的dna片段，过量表达bna-mir393能够影响甘蓝型油菜种子的细胞形态，证实了该mirna的功能及其应用途径。
2、技术方案：本专利技术所述bna-mir393基因在调控甘蓝型油菜种子细胞形态中的应用。
3、进一步地，bna-mir393基因包含甘蓝型油菜bna-mir393前体序列(又称为前体mirna，前体mirna(pre-mirna)是618bp中的一部分)的dna片段，所述dna片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，序列长度为618bp。
4、进一步地，bna-mir393基因的成熟序列核苷酸序列如seq id no:2所示。
5、进一步地，所述甘蓝型油菜种子的细胞形态表型包括细胞的长、宽和/或面积。
6、进一步地，bna-mir393基因使甘蓝型油菜种子细胞整体变大。
7、一种改变甘蓝型油菜种子细胞形态的转基因植物的培育方法，包括以下步骤：
8、(1)利用电击法将带有甘蓝型油菜bna-mir393前体序列的质粒转化农杆菌；
9、(2)将带有转化质粒的农杆菌采用转基因方法转化目标植物，得到转基因植物。
10、进一步地，所述的目标植物为甘蓝型油菜。
11、进一步地，所述转基因植物种子的细胞形态明显区别于所述目标植物。
12、进一步地，甘蓝型油菜bna-mir393前体序列的dna片段以设计引物f和设计引物r为引物，利用rt-pcr进行dna扩增得到，所述设计引物f的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述设计引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示。
13、进一步地，携带有本专利技术包含bna-mir393前体序列的dna片段的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体，直接dna转化、微注射、电击转化等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998,method for plant molecular biology viii,academy press,newyork,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plant molecular biology(2ndedition))。
14、进一步地，利用dna回收试剂盒回收上述包含bna-mir393前体序列的dna片段，利用酶切连接的方法将此片段连入pmdc83骨架载体，构建该dna片段的过量表达载体，命名为pmdc83-mir393。
15、进一步地，利用电转法将pmdc83-mir393载体导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为gv3101。通过农杆菌侵染介导的遗传转化方法将pmdc83-mir393转化甘蓝型油菜受体材料j9712，成功获得了bna-mir393表达量相对于野生型显著提高的转基因植株，观察发现，与野生型植株相比，过量表达bna-mir393的转基因甘蓝型油菜种子的细胞形态发生明显变化，说明bna-mir393能够调控甘蓝型油菜种子细胞发育。
16、本专利技术还包括所述的培育方法得到的转基因植物。
17、本专利技术以甘蓝型油菜为研究材料，通过前期甘蓝型油菜种子不同发育时期rna-seq比较分析，发现bna-mir393在甘蓝型油菜种子发育过程中明显差异表达，说明该mirna可能参与调控甘蓝型油菜种子的发育。因此，从甘蓝型油菜中分离包含bna-mir393前体序列的dna片段，并鉴定bna-mir393在甘蓝型油菜种子发育过程中所发挥的功能，对于甘蓝型油菜种子的品质和产量性状改良将具有非常重要的意义。
18、本专利技术分离和应用一种包含bna-mir393前体序列(又称为前体mirna，前体mirna(pre-mirna)是618bp中的一部分)的dna片段，其序列如seq id no:1所示，序列长度为618bp，其对应的mirna成熟序列如seq id no:2所示，该成熟mirna具有调控甘蓝型油菜种子细胞形态的能力。利用农杆菌介导法转化到野生型甘蓝型油菜植株中，并研究其在甘蓝型油菜体内的生物学功能，为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Bna-miR393基因在调控甘蓝型油菜种子细胞形态中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Bna-miR393基因包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Bna-miR393基因的成熟序列核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘蓝型油菜种子的细胞形态表型包括细胞的长、宽和/或面积。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Bna-miR393基因使甘蓝型油菜种子细胞整体变大。
6.一种改变甘蓝型油菜种子细胞形态的转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述的目标植物为甘蓝型油菜。
8.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述转基因植物种子的细胞形态明显区别于所述目标植物。
9.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，甘蓝型油菜Bna-miR
10.根据权利要求6-9任一项所述的培育方法得到的转基因植物。
...【技术特征摘要】
1.bna-mir393基因在调控甘蓝型油菜种子细胞形态中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bna-mir393基因包含甘蓝型油菜bna-mir393前体序列的dna片段，所述dna片段的核苷酸序列如seq idno:1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bna-mir393基因的成熟序列核苷酸序列如seq id no:2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甘蓝型油菜种子的细胞形态表型包括细胞的长、宽和/或面积。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bna-mir393基因使甘蓝型油菜种子细胞整体变大。
6.一种改...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋金金，朱昊天，王幼平，朱双，钱昊福，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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