一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用技术

本发明专利技术公开一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coliUR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH

【技术实现步骤摘要】
一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其是一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用。

技术介绍

[0002]胞苷属于嘧啶核苷类化合物，是生物体合成RNA的组成成分，在生物体中起到重要的代谢、遗传等调控作用，并参与生物体内各种生理生化过程。胞苷用途十分广泛，涉及食品、医药、保健品等行业。在医药领域应用价值尤为显著，主要作为一些抗病毒和抗肿瘤药物的中间前体物质，也是生产阿糖胞苷、环胞苷、胞二磷胆碱等药物的原材料。胞苷具有十分重要的实用价值，随着胞苷市场需求量的不断扩大，迫切需要成本低且高效的胞苷生产工艺。
[0003]胞苷的生产方法有RNA水解法、化学合成法、微生物发酵法。应用较为广泛的是RNA水解法和化学合成法。RNA水解法需要大量优质的RNA原料，成本较高。水解后得到的是混合产品，分离提纯的过程繁琐，操作复杂，还会产生许多副产物，导致产销失衡。胞苷的化学合成法主要以胞嘧啶和核糖或尿苷为原料合成胞苷，需要添加甲苯磺酸和四氯化钛作为催化剂，化学合成法具有反应路线长、生产成本高、产品收率低、环保压力大等缺点，限制了其工业化大规模生产。微生物发酵法生产胞苷具有投入低、产出高、操作简单等优点，是实现胞苷工业化生产的理想方法。
[0004]上世纪70年代，国外许多学者开始对嘧啶核苷合成途径进行研究，选取的菌株主要有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，这为胞苷生产菌的选育奠定了科学的理论基础。大肠杆菌中胞苷的合成需要经过一系列的代谢反应。第一步，谷氨酰胺、天冬氨酸和5
‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸(PRPP)等前体物质经过六步酶催化反应生成尿苷酸(UMP)。第二步，合成的UMP进行分流代谢，一部分UMP在核苷酸酶和尿苷磷酸化酶的催化下生成尿嘧啶或直接经过尿嘧啶磷酸核糖转移酶生成尿嘧啶；另一部分UMP在尿苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胞苷三磷酸合成酶的作用下生成胞苷三磷酸(CTP)，CTP脱磷酸后生成胞苷。胞嘧啶合成路径长，反馈调节机制复杂，受多条代谢路径的干扰。
[0005]上世纪90年代，国外已有关于微生物发酵法生产嘧啶核苷的报道，国内在本世纪初才逐渐进行相关研究。早期胞苷生产菌株的选育主要采用诱变结合结构类似物抗性筛选的方法。例如，1989年Asahi S等以枯草芽孢杆菌B.subilis为出发菌株，经过诱变育种，得到一株生产能力为2.0g/L胞苷生产菌株(Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan,1989,53(1):97
‑
102.)；2007年盛春雷等以B.subilis DOS7
‑2‑
1000
‑
15为出发菌株，通过紫外诱变和结构类似物抗性筛选的方法提升CTP合酶活性，同时敲除胞苷脱氨酶基因，得到的菌株胞苷生产能力达到3.5g/L(生物技术,2007,17(5):57
‑
59.)；2009年李登奎等通过NTG诱变和结构类似物抗性筛选的方法，部分解除了枯草芽孢杆菌B.subilis K
‑
215中CTP合酶所受反馈抑制作用，胞苷积累量达到6.2g/L(中国药科大学学
报,2009,40(5):455
‑
459.)。2020年，李静等通过多轮次诱变筛选得到一株结构类似物抗性突变株，在50L发酵罐中胞苷产量达到90g/L，糖酸转化率达到30％，具有较好的工业应用前景(ZL202010188550.6)。但是，诱变选育的突变株存在遗传背景复杂，无效突变较多，生产活力不稳定，营养需求较高的问题，不利于连续生产过程。
[0006]利用代谢工程和基因编辑技术选育胞苷生产菌是近年来研究的热点。例如，2010年苏静等以B.subilis TS8为出发菌株，在保证遗传性能稳定的前提下通过Red同源重组的方法敲除了胞苷脱氨酶编码基因cdd，胞苷积累量达到1.72g/L，较原始菌株产量提高了44.19％(生物技术通讯,2010,21(1):39
‑
42.)；2017年刘爱霞等对E.coli W3110的嘧啶核苷途径进行了基因工程改造，解除了合成途径的反馈抑制，敲除了胞苷的降解及利用基因，过表达合成途径的关键酶，重组菌株在5L发酵罐中胞苷产量可以达到20g/L以上(ZL201710003833.7)。与传统诱变育种相比，基因工程育种具有遗传背景清晰，突变位点少，连续生产稳定性强的特点。但是目前依靠基因工程技术选育的胞苷生产菌的产量和糖酸转化率均较低，无法真正用于工业化生产。
[0007]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用。
[0009]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0010]一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH
(D90A)
；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG
(E156K)
；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。
[0011]其中，所述Cdd的基因序列为SEQ ID NO.1，YgdH的基因序列为SEQ ID NO.2，CmK的基因序列为SEQ ID NO.3，YhdE的基因序列为SEQ ID NO.4，MazG的基因序列为SEQ ID NO.5，NudG的基因序列为SEQ ID NO.6，PyrH
(D90A)
的基因序列为SEQ ID NO.7，PyrG
(E156K)
的基因序列为SEQ ID NO.9，NrdD的基因序列为SEQ ID NO.11。
[0012]进一步地，所述尿苷基因工程菌E.coli UR11(ZL201810020944.3)是在E.coli W3110(ATCC27325)的基因组上整合了来源于B.subtilis A260(CGMCC No.11775)的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。
[0013]如上所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，所述方法是采用CRISPR/Cas9介本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，其特征在于：所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coli UR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrH
(D90A)
；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrG
(E156K)
；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。其中，所述Cdd的基因序列为SEQ ID NO.1，YgdH的基因序列为SEQ ID NO.2，CmK的基因序列为SEQ ID NO.3，YhdE的基因序列为SEQ ID NO.4，MazG的基因序列为SEQ ID NO.5，NudG的基因序列为SEQ ID NO.6，PyrH
(D90A)
的基因序列为SEQ ID NO.7，PyrG
(E156K)
的基因序列为SEQ ID NO.9，NrdD的基因序列为SEQ ID NO.11。2.根据权利要求1所述的胞苷的基因工程菌，其特征在于：所述尿苷基因工程菌E.coli UR11是在E.coli W3110的基因组上整合了来源于B.subtilis A260的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF。3.如权利要求1或2所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述方法是采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli UR11基因组进行定向改造。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤如下：(1)敲除胞苷脱氨酶基因cdd，cdd基因序列为SEQ ID NO.1；(2)敲除嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，ygdH基因序列为SEQ ID NO.2；(3)敲除胞苷酸激酶基因cmK，cmK基因序列为SEQ ID NO.3；(3)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE，yhdE基因序列为SEQ ID NO.4；(4)敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG，mazG基因序列为SEQ ID NO.5；(5)在假基因位点yeeP、mbhA、yjiT分别整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，nudG基因序列为SEQ ID NO.6，由强启动子Ptrc控制；(6)在胞苷脱氨酶基因位点cdd和假基因位点yghE分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH
(D90A)
，cdd基因序列为SEQ ID NO.1，pyrH
(D90A)
基因序列为SEQ ID NO.7，由强启动子Ptrc控制，尿苷酸激酶氨基酸序列为SEQ ID NO.8；(7)在胞苷酸激酶基因位点cmK、假基因位点ilvG分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG
(E156K)
，cmK基因序列为SEQ ID NO.3，pyrG
(E156K)
基因序列为SEQ ID NO.9，由强启动子Ptrc控制，胞苷三磷酸合酶氨基酸序列为SEQ ID NO.10；(8)敲除核苷三磷酸还原酶基因nrdD，nrdD基因序列为SEQ ID NO.11。5.根据权利要求4所述的构建方...

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓光，安俊侠，刘欢，刘亚琦，宋雪静，徐庆阳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：