一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术实施例公开了一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用。该重组枯草芽孢杆菌是通过基因工程方法在整合型质粒pDG364的基础上构建了一个以芽孢衣壳蛋白CotB为锚定蛋白表面展示猪PCV2Cap截短抗原蛋白的重组载体，通过化学转化方法将重组载体转化到野生型枯草芽孢杆菌168中而获得，其具有遗传稳定性，不会在传代的过程中丢失。该菌直接将抗原蛋白展示在芽孢表面，无需破碎，可直接拌料或通过饮水免疫动物，免去了大规模注射的繁琐流程。且得益于芽孢良好的抗逆性，该菌易于保存及运输，大大降低成本。该菌可以诱导特异性的免疫反应，这为猪圆环病毒2型的防治提供了一种新的途径，可以用于开发商品化疫苗。以用于开发商品化疫苗。以用于开发商品化疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程相关
，具体地说是涉及一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒病(Porcine circovirus diseases，PCVD)主要是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)引起的猪的一种传染病，主要感染家猪和野猪，牛、山羊等动物偶有报道。猪感染PCV2后，机体发生免疫抑制，进而出现免疫缺陷，淋巴细胞缺失，以及淋巴组织中巨噬细胞浸润等与多系统衰竭综合征(PMWS)相关的病理特征，主要在呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、生殖和被膜系统上表现出临床症状。1998年，我国首次确诊猪圆环病毒2型的感染，目前PCV主要分为3个基因型即PCV1、PCV2和PCV3，PCV1 一般不致病，PCV2和PCV3具有致病性，PVC2在我国为各地的主要流行病毒基因型。PCV2常导致猪圆环相关疾病，包括断奶后PMWS、皮炎肾病综合征、先天性震颤、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍(后期流产)等，具有较高的发病率和死亡率。临床上，PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等形成多重感染，并常与副猪嗜血杆菌、链球菌及胸膜肺炎放线杆菌等形成继发性混合感染，从而给养猪业带来巨大的经济损失。
[0003]目前，对于PCV2的感染，仍无特效治疗药物，疫苗预防是最主要手段，商品化疫苗在防控上具有重要作用。现阶段临床上应用的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗，这两类疫苗对PCV2的防控起到了重要作用，通过疫苗接种能减轻PCV对猪淋巴组织的损害作用、降低病毒血症，使PCV2在猪体内的复制水平显著下降；由于PCV2全病毒灭活疫苗具有安全、易生产、遗传稳定和无需冷藏等优点而被广泛应用，但全病毒灭活疫苗存在一个较大的问题，不能获得高效价抗体水平；全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗虽然在防控PCV2方面起到一定作用，但不能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，不能将猪群体内的病毒完全清除；随着分子生物学技术的发展，活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗等新型疫苗成为目前主要的研究热点。但这些已经推广使用及正在研究的疫苗，各自存在一定弱点，如疫苗抗原产量较低、疫苗生产检验和效力评价、商品化疫苗价格较高、不能有效清除病毒血症、不能很好地对细胞免疫、黏膜免疫产生影响等问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术之不足，本专利技术提供了一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型 Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌。
[0005]所述重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与猪圆环病毒2型截短Cap基因进行融合，并将获得的融合基序CotB
‑
tCap转入枯草芽孢杆菌168中而获得。
[0006]其中，所述融合基序CotB
‑
tCap的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其主要包括如下步骤：
[0008](1)以猪圆环病毒2型为模板扩增编码Cap蛋白的截短ORF2基因序列，所述Cap蛋白截短ORF2基因序列的扩增引物1如下所示：
[0009]tCap
‑
F1:CGGGATCCTATGAATGGCATCTTC BamHⅠ[0010]tCap
‑
R1:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC EcoRI
[0011]所述截短Cap蛋白基因ORF2的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：
[0012]tCap
‑
F2:CCGAAGCTTATGAATGGCATCTTC HindⅢ[0013]tCap
‑
R2:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC EcoRI；
[0014](2)将按照tCap
‑
F1，tCap
‑
R1扩增得到的截短Cap蛋白基因ORF2进行密码子的优化以去除其中的酶切位点序列，获得优化后的tCap序列；优化后的tCap 序列经T
‑
A克隆连接至pUCm
‑
T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm
‑
T
‑
tCap；
[0015](3)将步骤(2)得到的重组质粒pUCm
‑
T
‑
tCap与大肠杆菌表达质粒pET
‑
32a 经BamHⅠ，EcoRI双酶切后分别胶回收tCap片段与线性化质粒pET
‑
32a，再经 DNA连接酶将其连接并转化入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，获得重组表达质粒pET
‑
32a
‑
tCap；
[0016](4)以步骤(3)得到的重组表达质粒pET
‑
32a
‑
tCap为模板，用tCap
‑
F2， tCap
‑
R2引物进行PCR以更换酶切位点，获得的产物经T
‑
A克隆连接至pUCm
‑
T 载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm
‑
T
‑
tCap2；重组质粒pUCm
‑
T
‑
tCap2与重组整合质粒pDG364
‑
CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收tCap片段与pDG364
‑
CotB，再经DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α获得重组整合质粒pDG364
‑
CotB
‑
tCap2；
[0017](5)将步骤(4)中得到的重组整合质粒pDG364
‑
CotB
‑
tCap2通过化学转化方法转入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，通过筛选，得到在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap抗原蛋白的重组枯草芽孢杆菌。
[0018]其中，在所述步骤(2)中，优化后的tCap序列如Seq ID No.2所示。
[0019]其中，在所述步骤(4)中，通过氯霉素平板、淀粉酶活性试验和/或免疫荧光试验进行筛选。
[0020]一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗猪圆环病毒感染的生物制品中的应用。
[0021]一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗猪圆环病毒感染的疫苗中的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术实施例的在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与猪圆环病毒2型截短Cap基因进行融合，并将获得的融合基序CotB
‑
tCap转入枯草芽孢杆菌168中而获得。2.根据权利要求1所述的一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述融合基序CotB
‑
tCap的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。3.一种在芽孢表面展示猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)以猪圆环病毒2型为模板扩增编码Cap蛋白的截短ORF2基因序列，所述Cap蛋白截短ORF2基因序列的扩增引物1如下所示：tCap
‑
F1:CGGGATCCTATGAATGGCATCTTC BamHⅠtCap
‑
R1:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC EcoRI所述截短Cap蛋白基因ORF2的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：tCap
‑
F2:CCGAAGCTTATGAATGGCATCTTC HindⅢtCap
‑
R2:CGCGAATTCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC EcoRI；(2)将按照tCap
‑
F1，tCap
‑
R1扩增得到的截短Cap蛋白基因ORF2进行密码子的优化以去除其中的酶切位点序列，获得优化后的tCap序列；优化后的tCap序列经T
‑
A克隆连接至pUCm
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T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm
‑
T
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tCap；(3)将步骤(2)得到的重组质粒pUCm
‑
T
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tCap与大肠杆菌表达质粒pET
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32a经BamHⅠ，EcoRI双酶切后分别胶回收tCap片段与线性化质粒pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：潘康成，李威杰，张鑫，宋洪宁，刘明刚，
申请(专利权)人：四川生力源生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：