灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP及其应用制造技术

本发明专利技术公开了灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP及其应用，灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，将LsSGSP基因的dsRNA将其导入灰飞虱，沉默LsSGSP基因后，能够显著降低灰飞虱的取食能力，使其存活率下降，这表明灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP在灰飞虱取食过程中发挥关键性作用，同时在生物防治灰飞虱中具有重要的价值，具有良好的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP及其应用


[0001]本专利技术涉及生物防治领域，具体涉及灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP，还涉及LsSGSP在灰飞虱防治中的应用。

技术介绍

[0002]灰飞虱(Laodelphax striatellus)是我国及亚洲其他水稻种植地区重要的害虫。自上世纪60年代开始，灰飞虱在我国多个稻区频繁暴发成灾，严重威胁我国的粮食安全。灰飞虱主要通过直接刺吸植物汁液、产卵以及传播水稻病毒为害。在田间，灰飞虱常以成虫、若虫群聚于稻丛刺吸茎叶组织汁液，消耗株养分，使谷粒不饱满千粒重减轻。目前，灰飞虱的防控以化学农药为主，随着灰飞虱抗药性不断增强，化学农药的用药量及用药次数不断增加，这也给农田生态环境及稻米质量安全造成严重威胁。鉴于其危害的严重性，2020年农业农村部将包括灰飞虱在内的稻飞虱列入《一类农作物病虫害名录》。
[0003]唾液腺是灰飞虱重要的分泌器官。灰飞虱取食过程中分泌的胶状唾液和水状唾液主要由唾液腺分泌，并通过唾液道注入植物组织内。唾液腺在灰飞虱取食、消化、传毒等过程中发挥重要作用。研究发现，很多与灰飞虱取食相关的基因在唾液腺中特异表达，这些基因的功能及其在灰飞虱防治中的用途有待进一步挖掘。
[0004]RNA干扰技术是近年来生命科学研究的热点。它通过小分子双链RNA特异性地降解或抑制靶标基因mRNA表达，进而抑制或关闭特定基因。RNA干扰技术具有高特异性、高效率、便于操作等优点。目前，该技术已广泛应用于多种农业害虫的防控，即通过向昆虫体内导入特异的dsRNA，进而达到控制害虫种群或降低害虫传毒能力的目的。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP；本专利技术的目的之二在于提供扩增所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的引物；本专利技术的目的之三在于提供沉默所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的试剂在制备灰飞虱防治剂中的应用，本专利技术通过靶向灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP，进而达到抑制蜜露分泌量，抑制灰飞虱取食，降低灰飞虱存活率，减轻灰飞虱对水稻为害的目的，为灰飞虱的防治提供新的防治剂。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP，所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术优选的，所述灰飞虱LsSGSP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]2、扩增所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0010]3、所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的dsRNA。
[0011]本专利技术优选的，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]本专利技术优选的，所述dsRNA由以下方法制得：以SEQ ID NO.5所示的DNA模板，使用
Master Mix，并用无RNase水补齐到8μl；混匀后在37℃孵育5min以去除污染的基因组DNA；接着，往体系内加入2μl 5
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RT Master Mix；混匀后在37℃孵育1h最后，98℃变性5min，使反转录酶失活并最终获得灰飞虱唾液腺cDNA；
[0029](4)根据LsSGSP基因的开放阅读框(SEQ ID NO.1)设计引物如表1所示，编码氨基酸如SEQ ID NO.2所示，引物由杭州有康生物科技有限公司合成；
[0030]表1、LsSGSP基因扩增引物
[0031][0032](5)以灰飞虱唾液腺cDNA为模板，利用表1所示引物，对目的基因进行PCR扩增，具体扩增体系为：Max Buffer 25μl，dNTP Mix(10mM each)1μl，Max Super
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Fidelity DNA Polymerase 1μl，上下游引物各1μl，灰飞虱唾液腺cDNA模板1μl，最后用ddH2O补齐至50μl。PCR扩增条件为：95℃3分钟；95℃15秒，60℃1分钟，35个循环；72℃10分钟。
[0033]灰飞虱LsSGSP基因单克隆菌株获取：
[0034](1)利用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，结果如图1所示，分离后用刀片切取目的片段；
[0035](2)使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工生物，SK8131)回收目的DNA：从琼脂糖凝胶中将含有目的片段的琼脂糖切下，放入离心管中；加入5倍体积胶溶解液Buffer B2，70℃水浴10分钟；将溶解好的胶溶液加入吸附柱中，8,000g离心30秒，弃废液；加入500μl wash Solution，9,000g离心30秒，弃废液；空吸附柱9,000g离心1分钟；将吸附柱放入新的离心管中，在吸附柱中央加入30μl ddH2O；10,000g离心2分钟，最终获得纯化后的灰飞虱LsSGSP基因DNA片段；
[0036](3)使用平末端克隆试剂盒(北京擎科生物有限公司)将灰飞虱LsSGSP基因的DNA片段连接到pClone007载体：在0.2ml离心管中依次加入1μl灰飞虱LsSGSP基因DNA片段，1μl pClone007 Blunt simple载体；1μl 10
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buffer，最后用ddH2O补齐至10μl，将样品混匀后在25℃反应5分钟；
[0037](4)将连接产物加入到感受态中，用手轻弹管壁，冰浴30分钟；将离心管转移到42℃水浴90秒，迅速拿出在冰上静置2分钟；在离心管中加入500μl无抗LB培养基，180rpm摇1小时；取100
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200μl菌液涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板上；
[0038](5)挑取单菌落至1ml含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基，180rpm摇6小时，菌液进行菌落PCR，反应体系为：Max Buffer 12.5μl，dNTP Mix(10mM each)0.5μl，Max Super
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Fidelity DNA Polymerase 0.5μl，上下游引物各0.5μl，菌液1μl，最后用ddH2O补齐至25μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟；
[0039](6)利用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，挑选重组克隆，送杭州有康生物科技有限公司进行测序，得到504bp的灰飞虱LsSGSP基因序列，所得序列如SEQ ID NO.5所示。
[0040]实施例2、灰飞虱LsSGSP基因的dsRNA合成
[0041]T7引物PCR扩增与纯化
[0042](1)以含有灰飞虱LsSGSP基因的重组质粒或菌液为模板，利用带T7启动子序列(LsSGSP
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F引物下划线序列)的引物(表2所示)扩增目的基因，引物由杭州有康生物科技有限公司合成，扩增体系为Max B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP，其特征在于：所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP，其特征在于：所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.扩增权利要求1所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的引物，其特征在于：所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4.权利要求1所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的dsRNA。5.根据权利要求4所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。6.根据权利要求4或5所述灰飞虱唾液腺特异基因LsSGSP的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA由以下方法制得：以SEQ ID NO.5所述序列的DNA模板，使用T7High Yield RNA转录试剂盒，在反应体系为2μl 10
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄海剑，李俊敏，张传溪，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：