一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有第490位G

【技术实现步骤摘要】
一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及遗传工程
，更具体地，涉及一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体及其应用。

技术介绍

[0002]烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，占烟草总生物碱的95%左右。随着国内细支烟、新型烟草如电子烟市场的迅速发展，烟草工业对高烟碱含量烟叶的需求日益迫切。过去的研究表明：NtMYC2a基因是烟碱合成调控中的正调控因子。其氨基酸序列中含有一个JID结构域，烟碱合成负调控因子JAZ蛋白与该结构域互作而抑制NtMYC2a正调控烟碱合成的功能。利用生物技术手段提高烟草烟叶烟碱含量，对于生产高烟碱烟叶、降低烟碱的生产成本有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术主要目的在于获得提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，在此基础上，提供提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的应用，用于提高烟草植株的烟叶烟碱含量。
[0004]本专利技术采用如下技术方案实现。
[0005]本专利技术的第一个目的在于，提供一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有第490位 G
→
A的突变，使该基因编码蛋白质序列第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺。
[0006]本专利技术中，NtMYC2a基因CDS 490位的G突变为A，造成天冬氨酸转变成天冬酰胺。该突变在现有文献中并未被提到，更没有任何关于该突变能提高云烟87烟草植株烟叶烟碱含量的报道；且专利技术人发现，该突变能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量。
[0007]进一步地，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术的第二个目的在于，NtMYC2a基因突变体应用于提高烟叶烟碱含量，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体在获得烟叶烟碱含量提高的烟草植株中的应用。
[0009]NtMYC2a基因突变体的制备方法如下，该制备方法包括EMS诱变烟草种子和TILLING筛选烟草突变体；EMS诱变烟草种子：（1）：选用58% 漂白水处理云烟87种子6 分钟，离心滤干，待用；（2）：将步骤（1）中漂白处理后的云烟87种子利用去离子水对种子进行漂洗1 分钟，离心滤干去除漂白水成分；（3）：在室温条件下，去离子水浸泡步骤（2）中得到的去除漂白水成分并滤干的烟草种子12 小时，离心滤干；
（4）：在室温条件下，0.5% EMS（甲基磺酸乙酯）处理步骤（3）中得到的烟草种子12 小时，离心滤干；（5）：将步骤（4）中得到的烟草种子加入去离子水漂洗1 分钟，离心滤干，重复漂洗８次；然后使用布氏漏斗滤纸过滤干燥，得到诱变处理后的M1代种子。
[0010]TILLING筛选核苷酸变化的突变体：（6）：将步骤（5）中得到的诱变处理后的M1代烟草种子播种于大田，单株套袋自交收种获得M2代，每个M1代单株收获的M2代种子播种1粒种子，得到多株M2代突变体单株；（7）：取步骤（6）中得到的多株M2代突变体单株叶片，利用QIAGEN DNA提取试剂盒提取叶片DNA，得到多个样品；（8）：样品浓度测定及建池：将多个样品按照顺序大小排列，分别取2ul DNA样品在16通道 Tecan infinite M200仪器上进行浓度测定；将所有的样品浓度稀释至40ng/ul，制作8倍DNA池用于TILLING分析。
[0011]（9）: 利用Primer3设计NtMYC2a基因TILLING分析引物，M3 Til F：CATATTTCAACCAAGAGTCA和M3 Til R：GGTATTCCTTGAAGGAACTG扩增长度为730bp左右。
[0012]（10）: TILLING分析 M2代突变体，筛选核苷酸突变的单株，并进行测序验证，获得一个突变体，其CDS 490位的G突变为A，造成天冬氨酸变成天冬酰胺。
[0013]（11）: 步骤（10）中获得的突变体植株继续经过自交形成纯合突变体株系。
[0014]（12）: 对步骤（11）中得到的纯合突变体株系进行烟碱含量测定，具体为在烟株旺长期，取烟株中部叶片，杀青烘干，检测烟碱含量。
[0015]（13）: 含有突变序列的烟草株系相比含有SEQ ID NO:1序列的烟草叶片烟碱含量提高58%左右。
[0016]本专利技术的有益效果为，1、本专利技术通过系统研究，首次提出了一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，本专利技术提出的提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体植株，烟叶中烟碱含量比对照提高约58%，使烟叶的烟碱含量显著提高。
[0017]2、本专利技术通过系统研究，利用TILLING技术筛选核苷酸变化的突变体，获得NtMYC2a基因CDS区 490位的G突变为A，造成天冬氨酸转变成天冬酰胺的突变体，该突变体使烟叶的烟碱含量显著提高，降低了烟碱原料生产成本。
附图说明
[0018]图1为突变体突变位点测序峰图。
[0019]图2为本专利技术NtMYC2a突变体株系myc2a
‑
490与对照云烟87叶片烟碱含量对比示意图。
[0020]下面结合附图和具体实施方式本专利技术做进一步解释。
具体实施方式
[0021]下面详细描述本专利技术的实施例。
[0022]实施例1，本专利技术提供了一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体。根据本专利技术的实施例，提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的野生型NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有CDS 490位的G转变为A的突变，使该基因编码蛋白质序列第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺。
[0023]以云烟87为例，野生型的NtMYC2a基因的cDNA序列如下所示（SEQ ID NO：1）。
[0024]本专利技术的NtMYC2a基因突变体，在上述野生型云烟87 序列的加框处由碱基G突变为A（SEQ ID NO：3）。该位点的单核苷酸改变导致NtMYC2a蛋白第164位氨基酸由天冬氨酸转变成天冬酰胺（SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4）。
[0025]研究发现，该突变体与烟草植株的烟叶烟碱含量密切相关，从而利用该突变体，获得烟叶烟碱含量高的烟草株系；根据本专利技术的实施例，该突变体的核酸为培育高烟碱烟草品种提供基因资源，降低烟碱原料生产成本。
[0026]实施例2，请参考图1，根据本专利技术的第二方面，提出了NtMYC2a突变体的制备方法, 具体制备方法包括以下步骤：1、烟草种子EMS诱变（1）、选用58% 漂白水处理云烟87种子6 分钟，离心滤干，待用；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体，其特征在于：所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtMYC2a基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC2a基因突变体具有第490位 G
→
A的突变。2.根据权利要求1所述提高烟叶烟碱含量的NtMYC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙武，赵璐，高玉龙，孔光辉，贺晓辉，隋学艺，宋中邦，张谊寒，焦芳婵，吴兴富，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：