氨甲酰水解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种氨甲酰水解酶突变体SEQ ID NO:3，其能够高效催化N

【技术实现步骤摘要】
氨甲酰水解酶突变体


[0001]本专利技术属于酶催化
，具体地说，涉及一种氨甲酰水解酶突变体及其在D
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对羟基苯甘氨酸合成中的应用。

技术介绍

[0002]D
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对羟基苯甘氨酸(又称左旋对羟基苯甘氨酸，英文名称D
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p
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hydroxyphenylglycine,D
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HPG)是合成β
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内酰胺类半合成广谱抗生素例如阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、羟氨苄唑头孢、头孢罗齐、头孢曲嗪等的重要侧链原料化合物，也是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味剂的重要中间体，具有广泛的商业应用价值。
[0003]D
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HPG合成方法大致分两类，一类是化学合成法，另一类是生物酶法。化学法合成D
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HPG又有三种，一是通过对甲氧基苯甲醛和氰化钠在水溶液或者醇溶液里面，经过环合，加压碱水解和脱甲基，得到混旋的DL
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HPG；二是乙醛酸与苯酚反应生成对羟基α
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羟基苯乙酸，再在酸性或碱性情况下于50～70℃反应，接缩合成DL
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对羟基苯海因，再水解生成DL
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HPG；三是以乙醛酸水溶液、苯酚和铵盐为原料，采用一步法合成DL
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HPG。但所有的化学方法合成的产物均为混旋的DL
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HPG，后面都要通过化学拆分剂如溴代樟脑磺酸、邻甲基苯磺酸、磺基水扬酸、苯基乙磺酸等进行手性拆分才能得到D/>‑
HPG。化学合成法存在消旋体手性拆分剂价格较高，反应总收率不高，而且能耗高的问题，不符合当下绿色制造的理念。
[0004]生物酶法是当前国内外研究比较多的拆分方法，生物酶法具有光学活性单一、能源消耗少、“三废”污染小等优点。例如以DL
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对羟基苯海因为原料，在D
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海因酶和氨甲酰水解酶双酶作用下催化生成D
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HPG。首先，D
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海因酶能选择性地将外消旋DL
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对羟基苯海因中D型水解为N
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氨甲酰
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D
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对羟基苯甘氨酸(NC
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D
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HPG)，残留L
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对羟基苯海因在中性或碱性条件下，会迅速自发地消旋为DL
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对羟基苯海因，消旋的DL
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对羟基苯海因最终接近于完全转化为D
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HPG，这样省去了先合成外消旋混合物再拆分的繁琐步骤，可直接得到期望产物。近年来，双酶法制备D
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氨基酸由于经济、环境友好及底物范围广等优点具有潜在的应用价值而备受关注。
[0005]专利CN201510457039.0公开了采用从海洋链霉菌(Streptomyces sp.7
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145(CGMCCNO.7914))来源的N
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氨甲酰
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D
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对羟基苯甘氨酸水解酶(DCase)及其突变体可用于将NC
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D
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HPG水解为D
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HPG。

技术实现思路

[0006]我们在对现有技术报道的氨甲酰水解酶/DCase进行实验测试时发现，这些酶在催化底物NC
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D
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HPG水解反应时，要么存在底物或产物抑制性，要么热稳定性较差，一般在40℃以上反应温度下容易失活，难以长时间保持酶活力。例如，CN201510457039.0公开的DCase及其突变体在底物NC
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D
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HPG初始浓度达到5％后酶活力就趋于明显下降，反应体系中添加再多量的酶也难以使反应速度相应地提高，提示存在底物或产物D
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HPG抑制性。
[0007]氨甲酰水解酶催化底物NC
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D
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HPG水解的反应速度一般都不太快，基本都需要较长
时间。然而该反应过程中很容易遭到氧化破坏，导致副产物产生，严重影响产品收率和质量，因此理想的反应过程是反应速度尽可能高，例如采用较高反应温度，同时避免高温导致酶的变性失活，又要避免氧气存在。
[0008]该反应特点要求使用的氨甲酰水解酶没有底物/产物抑制性、或者抑制性很低，具有较高的热稳定性，对氧气不敏感，尽可能高的酶活力，较高的立体选择性。为寻找符合这些要求的酶，专利技术人对于众多文献中报道的氨甲酰水解酶/Dcase或它们的同工酶进行了比较和筛选，最终发现Hirokazu NANBA等在文献(Hirokazu NANBA,Yasuhiro IKENAKA,et al.,Isolation of Agrobacterium sp.Strain KNK712 That Produces N
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Carbamyl
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D
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Amino Acid Amido hydrolase,Cloning of the Gene for this Enzyme,and Properties of the Enzyme.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,Volume 62,Issue 5,1January 1998.DOI:10.1271/bbb.62.875.)中报道的农杆菌(Agrobacterium sp.Strain KNK712)来源的N
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氨甲酰
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D
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氨基酸酰胺水解酶(akDCase，SEQ ID NO:1)在用于催化NC
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D
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HPG水解方面表现出优秀的底物和产物耐受力，耐氧化环境，并且具有高度的立体选择性，因此专利技术人将其作为氨甲酰水解酶来进行重点研究。
[0009]为了提高初始氨甲酰水解酶akDCase的热稳定性和酶活力，我们通过突变方式进行结构改造，经过大量的筛选，得到了几个综合性能优良的突变体，不仅热稳定性好，而且几乎没有底物/产物抑制性，有潜力应用于D
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对羟基苯甘氨酸的酶法生产。具体而言，本专利技术包含如下技术方案：
[0010]一种氨甲酰水解酶突变体，其为选自下述的多肽：
[0011](a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
[0012](b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有85％以上、优选90％以上、优选95％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且在45℃以上反应环境中的酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
[0013]MTRQMILAVGQQGPIARAETREQVVVRLLDMLTKAASRGANFIVFPELALTTFFPRWYFTDEAELDSFYETEMPGPVVRPLFEKAAELGIGFNLGYAELVVEGGVK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨甲酰水解酶突变体，其为选自下述的多肽：(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且在45℃以上反应环境中的酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。2.如权利要求1所述的氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述酶活力是指催化N
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氨甲酰
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D
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对羟基苯甘氨酸水解为D
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对羟基苯甘氨酸的酶活力。3.编码如权利要求1或2所述氨甲酰水解酶突变体的基因。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，编码氨甲酰水解酶突变体SEQ IDNO:3的基因是核苷酸序列为SEQ ID NO:4的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上同源性的多核苷酸。5.包含如权利要求4所述基因的质粒。6.一种用于表达如权利要求1或2所述氨甲酰水解酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，梁岩，韦炎龙，任亮，彭志杰，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：