【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种提高红霉素产量的新方法，具体涉及通过使菌株过表达atp合成酶β亚基提高红霉素发酵水平的方法。
技术介绍
1、红霉素是一种大环内酯类抗生素，以其广谱抗菌作用而闻名，主要由红色糖多孢菌(saccharopolyspora erythraea)通过发酵生产。红霉素广泛应用于医疗、农业和畜牧业等多个领域。红霉素的主要成分包括红霉素a、b、c和d，其中以红霉素a的抑菌效果最佳。多种红霉素的衍生物例如克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素已在临床上得到广泛使用，每年的销售额高达数十亿美元。因此，提升红霉素的发酵产量在社会和经济层面都具有重要意义。
2、传统上，通过优化发酵条件来提高红霉素产量的方式不仅耗费时间，还成本高昂。相比之下，利用基因工程手段在糖多孢红霉菌中敲除或增强关键基因的表达，可有效培育出高产菌株。这种方法具有操作简便、时间短、成本低且易于控制的优势，展现出广阔的应用前景。
技术实现思路
1、在通过基因工程定向改变基因来获得红霉素高产菌株的研究中，我们发现红霉素的生物合成过程中涉及的酰基转移、羟基化和糖基化等步骤都需要atp参与，以维持合成反应的正常进行。另一方面，atp还在前体物质的活化和运输过程中扮演重要角色，如将前体糖基化合物活化为核苷酸糖衍生物，从而成为红霉素分子的一部分。此外，atp水平还间接影响细胞内的代谢平衡，通过调控代谢通路和能量分配，优化红霉素的合成效率。因此，充足的atp供应是确保红霉素高效生物合成的基础，因此提高atp的合成可
2、本专利技术的第一方面提供了一种提高菌株红霉素产量的方法，包括下述步骤：使红霉素生产菌过表达atp合成酶β亚基、或者与其具有95％以上同源性、优选地96％以上同源性、优选地97％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性，且具有atp合成酶功能的保守性变异多肽。
3、优选地，上述atp合成酶β亚基是红色糖多孢菌(saccharopolyspora erythraea)来源的atp合成酶β亚基atpd(genbank:wp_211898549.1)，其氨基酸序列如seq id no:1所示，亦可写作atpd。
4、在一种实施方式中，上述红霉素生产菌是红色糖多孢菌。更优选上述红霉素生产菌是红色糖多孢菌atcc 11635。
5、优选地，上述atp合成酶β亚基的编码基因atpd的核苷酸序列为seq id no:2，或者是与seq id no:2与具有95％以上同源性、优选地96％以上同源性、优选地97％以上同源性、优选地98％以上同源性、更优地99％以上同源性的核苷酸序列。
6、可选地，上述过表达所述atp合成酶β亚基通过下述方式实施：
7、a.在红霉素生产菌基因组中所述atp合成酶β亚基的上游插入强启动子；和/或
8、b.在红霉素生产菌基因组中整合一个以上拷贝、优选两个以上、三个以上、四个以上、六个以上、八个以上拷贝的所述atp合成酶β亚基的编码基因；并且/或者
9、c.在红霉素生产菌宿主菌基因组中以质粒形式表达atp合成酶β亚基的编码基因。
10、上述步骤a或b可以是通过将包含所述atp合成酶β亚基编码基因的重组质粒转化入宿主菌中而实现，优选质粒载体是适合在红色糖多孢菌中表达的质粒载体，例如带有强启动子erme*p的整合型载体pib139。
11、上述步骤a中所述强启动子的插入方式、步骤b中所述基因组中的atp合成酶β亚基编码基因整合方式可以选自质粒转化和基因编辑技术。
12、上述基因编辑技术可以选自下组：同源双交换，talen系统，crispr-cas9系统，crispr-cpf1系统，crispr-cas12系统，crispr-best系统，mugent(multiplex genomeediting by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
13、本专利技术的第二个方面提供了一种重组质粒，该质粒载体是适合于在红色糖多孢菌中表达外源基因的质粒，并且包含所述atp合成酶β亚基编码基因atpd。
14、优选地，上述重组质粒的质粒载体是带有强启动子erme*p的整合型载体pib139(参见文献xinjuan ning,xinran wang,yuanting wu,qianjin kang*and linquan bai*:identification and engineering of post-pks modification bottlenecks foransamitocin p-3titer improvement in actinosynnema pretiosum subsp.pretiosumatcc 31280.biotechnology journal 2017,12,1700484.)等，但并不受限于此。
15、可选地，上述重组质粒的核苷酸序列如seq id no:3所示。
16、本专利技术的第三个方面提供了一种过表达如上所述atp合成酶β亚基的红色糖多孢菌工程菌，所述红色糖多孢菌工程菌在红色糖多孢菌基因组中整合了如上所述的atp合成酶β亚基编码基因；或者红色糖多孢菌工程菌是在宿主菌中转化了如上所述重组质粒的转化子。
17、本专利技术的第四个方面提供了上述红色糖多孢菌工程菌在发酵法生产红霉素中的用途。
18、本专利技术首次发现atp合成酶β亚基atpd(genbank:wp_211898549.1)具有增强红霉素代谢途径的新功能，通过使红色糖多孢菌过表达atp合成酶β亚基基因atpd，可以将红霉素产量提升55.6％，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持，具有良好的开发应用前景。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高菌株红霉素产量的方法，包括下述步骤：使红霉素生产菌过表达ATP合成酶β亚基、或者与其具有95％以上同源性且具有ATP合成酶功能的保守性变异多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ATP合成酶β亚基是红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)来源的ATP合成酶β亚基AtpD(GenBank:WP_211898549.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素生产菌是红色糖多孢菌。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ATP合成酶β亚基的编码基因atpD的核苷酸序列为SEQ ID NO:2或者是与SEQ ID NO:2与具有95％以上同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，过表达所述ATP合成酶β亚基通过下述方式实施：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A或B是通过将包含所述ATP合成酶β亚基编码基因的重组质粒转化入宿主菌中而实现，优选质粒载体是适合在红色糖多孢菌中表达的质粒载
7.一种如权利要求5或6中所述的重组质粒，其特征在于，该质粒载体是适合于在红色糖多孢菌中表达外源基因的质粒，并且包含所述ATP合成酶β亚基编码基因atpD。
8.如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
9.一种过表达如权利要求1中所述ATP合成酶β亚基的红色糖多孢菌工程菌，其特征在于，所述红色糖多孢菌工程菌在红色糖多孢菌基因组中整合了如上所述的ATP合成酶β亚基编码基因；或者红色糖多孢菌工程菌是在宿主菌中转化了如权利要求7或8所述重组质粒的转化子。
10.如权利要求9所述红色糖多孢菌工程菌在发酵法生产红霉素中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种提高菌株红霉素产量的方法，包括下述步骤：使红霉素生产菌过表达atp合成酶β亚基、或者与其具有95％以上同源性且具有atp合成酶功能的保守性变异多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述atp合成酶β亚基是红色糖多孢菌(saccharopolyspora erythraea)来源的atp合成酶β亚基atpd(genbank:wp_211898549.1)，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红霉素生产菌是红色糖多孢菌。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述atp合成酶β亚基的编码基因atpd的核苷酸序列为seq id no:2或者是与seq id no:2与具有95％以上同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，过表达所述atp合成酶β亚基通过下述方式实施：
6.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，步绪亮，梁岩，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。