一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。本发明专利技术所述固定化酶更易于分离，能降低后续除杂成本，节约流程；所用固定化载体环保易分解；同时固定化后的酶提高了转化率以及转化过程的稳定性，提高了酶的利用次数，节约了成本。了成本。

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用


[0001]本专利技术涉及固定化酶领域，特别涉及一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。

技术介绍

[0002]在利用酶催化底物烟酰胺核糖(NR)或其盐转化为烟酰胺单核苷酸(NMN)的过程中，酶通常以游离形式加入到底物中，通过搅拌使其与底物充分接触，但这种方式不可避免地存在酶的分布不均匀以及活性不稳定的问题，从而导致转化过程不够稳定、转化率不够高，且后续对酶的分离操作较复杂，另外，游离酶只能利用一次，无法进行回收。
[0003]在固定化酶领域方面，现有技术使用的固定化材料例如树脂、二氧化硅等，废弃后，均当固废处理，然而PHBV可以直接分解成CO2和水，绿色环保；此外，现有技术中固定化载体使用的量很多，例如50mg酶需要用1g的载体，或者90ml的酶液需要用160g载体。
[0004]CN112980906B公开了一种用于制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的酶组合物及其应用，利用环氧树脂作为载体，将NRK酶和PNP酶固定化。
[0005]CN111961659A公开了一种将聚乙烯醇、海藻酸钠、PHBV共聚物混合在一起对反硝化细菌进行固定，PHBV共聚物为反硝化细菌提供碳源。
[0006]目前的固定化酶载体较为不环保，且固定化所需载体量大，难以满足环保、成本和效率的综合要求。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中尚未有效果较佳的固定化NRK酶(烟酰胺核糖激酶)，以及缺乏环保、高效的固定化载体的技术缺陷，本专利技术提供了一种固定化酶及用其制备NMN的方法和应用。本专利技术首次将PHBV(Poly(3
‑
hydroxybutyrate
–
co
‑3‑
hydroxyvalerate)，聚(3
‑
羟基丁酸
‑
co
‑3‑
羟基缬草酸))应用于酶固定化，PHBV可分解且环境友好，适合工业生产；所述固定化酶可重复使用，回用多次后NRK酶依旧保持较高的活性(回用5次后NMN收率较佳可达87.65％)；与游离酶的转化过程相比，本专利技术所述固定化酶的转化过程更稳定，且转化率有所提高，反应2小时后NMN生成率较佳可达97.42％；所述固定化酶更易于分离，能降低后续除杂成本，且提纯过程较常规化过程更为简化，节约流程。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种固定化酶，其中，所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。
[0009]在一些实施方案中，所述固定化酶中被固定的酶为NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白。
[0010]在一些优选的实施方案中，所述NRK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述包含NRK酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]在一些实施方案中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白的质量比为1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:7、1:5、1:3、2:1、1:1、3:1、5:1、7:1、9:1和10:1。
[0012]本专利技术第二方面提供了一种制备本专利技术第一方面所述固定化酶的方法，其中，所
述方法包括如下步骤：
[0013]步骤S1：将所述PHBV溶于有机溶剂，得到混合物1；
[0014]步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，即得所述固定化酶。
[0015]在一些实施方案中，其中，步骤S1中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或多种，优选为二氯甲烷和乙醇。
[0016]在一些实施方案中，所述二氯甲烷和所述乙醇的体积比为1:4～4:1，例如3:7。
[0017]在一些实施方案中，所述PHBV与所述二氯甲烷的质量体积比为5g/20mL～15g/10mL，例如10g/15mL。
[0018]在一些实施方案中，所述步骤S1包括使用超声混匀，所述超声的时间为8～15min，例如10min。
[0019]在一些实施方案中，其中，步骤S2中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:7、1:5、1:3、1:1、2:1、3:1、5:1、7:1、9:1和10:1。
[0020]在一些实施方案中，步骤S2包括搅拌。
[0021]在一些优选的实施方案中，所述搅拌的温度为25～40℃，例如37℃。
[0022]在一些优选的实施方案中，所述搅拌的转速为100～200rpm，例如150rpm。
[0023]在一些优选的实施方案中，所述搅拌的时间为1.0～4.0h，例如3.5h。
[0024]在一些优选的实施方案中，对所述混合物2进行冻干，得到冻干粉形式的所述固定化酶。
[0025]在一些优选的实施方案中，所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白为酶液的形式。
[0026]在一些优选的实施方案中，所述方法包括如下步骤：
[0027]步骤S1：将所述PHBV溶于二氯甲烷，再溶于乙醇得到混合物1，所述二氯甲烷和所述乙醇的体积比为3:7，所述PHBV与所述二氯甲烷的质量体积比为10g/15mL；
[0028]步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为2:1和10:1，所述搅拌的温度为37℃，所述搅拌的转速为150rpm，所述搅拌的时间为3.5h，得所述固定化酶。
[0029]本专利技术第三方面提供了一种制备NMN的方法，其中，所述方法包括以下步骤：将如本专利技术第一方面所述固定化酶与原料混合，反应得NMN；所述原料包括NR或其盐。
[0030]在一些实施方案中，所述原料还包括以下中的一种或多种：ATP或其盐、镁盐和六偏磷酸钠。
[0031]在一些优选的实施方案中，所述固定化酶所述NR或其盐浓度比为1～10g/L:50～100mM，例如为3g/L:80mM。
[0032]在一些优选的实施方案中，所述固定化酶与所述ATP或其盐浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和3g/L:80mM。
[0033]在一些优选地实施方案中，所述固定化酶与所述镁盐浓度比为1～10g/L:30～60mM，例如3g/L:50mM。
[0034]在一些优选的实施方案中，所述固定化酶与所述六偏磷酸钠浓度比为1～10g/L:5～80mM，例如3g/L:8mM和3g/L:30mM。
[0035]在一些实施方案中，所述步骤还包括调节混合物的pH，所述pH为5.0～6.0，例如5.5。
[0036]在一些实施方案中，所述步骤的反应温度为35～45℃，例如40℃。
[0037]在一些优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：将本专利技术第一方面所述固定化酶与NR或其盐、ATP或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶使用PHBV作为固定化载体。2.如权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶中被固定的酶为NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白；优选地，所述NRK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述包含NRK酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白的质量比为1:10～10:1，例如2:1和10:1。3.一种制备如权利要求1所述固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤S1：将所述PHBV溶于有机溶剂，得到混合物1；步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，即得所述固定化酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或多种，优选地为二氯甲烷和乙醇；和/或，所述步骤S1包括使用超声混匀，所述超声的时间为8～15min，例如10min；和/或，步骤S2中，所述PHBV与所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白质量比为1:10～10:1，例如2:1和10:1；和/或，步骤S2包括搅拌；优选地，所述搅拌的温度为25～40℃，例如37℃；和/或，所述搅拌的转速为100～200rpm，例如150rpm；和/或，所述搅拌的时间为1.0～4.0h，例如3.5h；和/或，对所述混合物2进行冻干，得到冻干粉形式的所述固定化酶；和/或，步骤S2中，所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白为酶液的形式。5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤S1：将所述PHBV溶于二氯甲烷，再溶于乙醇得到混合物1；步骤S2：将所述NRK酶和/或包含NRK酶的融合蛋白加入所述混合物1，得到混合物2，所述P...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙华君，姚其凤，江汝泳，刘婷芬，韩丹，郭晨，赵威，胡琪，钱志强，
申请(专利权)人：湖北远大生命科学与技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：