一种检测和筛选细胞壁靶向抗生素的全细胞微生物传感器制造技术

本发明专利技术利用革兰氏阴性细菌奥奈达希瓦氏菌中能够感知和应答细胞壁损伤的双组分系统PghK/PghR及其调控的靶基因启动子P

【技术实现步骤摘要】
Screen,2002,7(2):127
‑
134.
[0009][3]Phelan R M,Dipardo B J,Townsend C A.A high
‑
throughput screen for the engineered production of beta
‑
lactam antibiotics[J].ACS Chem Biol,2012,7(5):835
‑
840.
[0010][4]Kobras C M,Mascher T,Gebhard S.Application of a Bacillus subtilis whole
‑
cell biosensor(P
liaI
‑
lux)for the identification of cell wall active antibacterial compounds[J].Methods Mol Biol,2017,1520:121
‑
131.
三、
技术实现思路

[0011]抗生素的研发面临瓶颈，尚未报道在革兰氏阴性菌中构建全细胞微生物传感器来检测和筛选细胞壁靶向抗生素。本专利技术基于双组分系统PghK/PghR及其特异性激活的blaA基因的启动子(P
blaA
)，在革兰氏阴性菌奥奈达希瓦氏菌中构建细胞壁靶向抗生素筛选平台，筛选潜在的细胞壁靶向抗生素产生菌。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0013]本专利技术提供一种报告质粒，所述报告质粒是将报告基因和位于所述报告基因上游的P
blaA
启动子构建到载体质粒上得到的。
[0014]进一步，所述报告基因为荧光素酶基因luxCDABE、荧光蛋白基因或β
‑
半乳糖苷酶基因。优选地，所述报告基因为荧光素酶基因luxCDABE。
[0015]进一步，所述P
blaA
启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0016]优选地，所述报告质粒是将P
blaA
启动子构建于含荧光素酶基因luxCDABE的质粒上获得。进一步，所述含荧光素酶基因luxCDABE的质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0017]更进一步，所述报告质粒(pBBR
‑
P
blaA
‑
lux)是将SEQ ID No:1所示P
blaA
启动子连接到SEQ ID No:2所示质粒的SpeΙ和BamHΙ位点之间上获得。所述报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
[0018]本专利技术还提供一种包含上述报告质粒的检测和筛选细胞壁靶向抗生素的全细胞微生物传感器，所述全细胞微生物传感器是将上述报告质粒转入blaA基因缺陷的S.oneidensis MR
‑
1菌株获得的。
[0019]热激法对本专利技术的宿主转化率很低，本专利技术优选所述报告质粒pBBR
‑
P
blaA
‑
lux以接合的方式转入blaA基因缺陷的Shewanella oneidensis MR
‑
1菌株。
[0020]具体地，所述的接合以含有所述报告质粒(优选pBBR
‑
P
blaA
‑
lux)的Escherichia coli WM3064菌株为供体菌。供体菌由热激法获得。
[0021]更为具体地，所述报告质粒(pBBR
‑
P
blaA
‑
lux)按如下步骤转入blaA基因缺陷的S.oneidensis MR
‑
1菌株：
[0022](1)将含有所述报告质粒的E.coli WM3064菌株接种至新鲜的含300μM2,6
‑
二氨基庚二酸的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，得到种子液A；所述种子液A以1％的体积接种量接种至新鲜LB液体培养基中37℃、200rpm培养至OD
600
＝0.4，得到菌液A；
[0023](2)将blaA基因缺陷的S.oneidensis MR
‑
1菌株接种至3mL新鲜LB液体培养基中30℃、200rpm培养12h，得到种子液B；所述种子液B以1％的体积接种量接种至新鲜LB液体培养基中37℃、200rpm培养至OD
600
＝0.4，得到菌液B；
[0024](3)以体积比为2：1混合所述菌液A和所述菌液B，离心，弃上清，底部菌体再两次用新鲜LB液体培养基重悬并离心后，所得沉淀加入新鲜LB液体培养基再次重悬，所得混合菌液滴加到含300μM 2,6
‑
二氨基庚二酸的LB平板表面，30℃下接合16h后，用新鲜LB液体培养基冲洗平板，所得冲洗液离心，所得沉淀重悬于新鲜LB液体培养基中并涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB平板上，30℃培养16h，挑取单菌落进行PCR验证，得到所述全细胞微生物传感器。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：本专利技术利用革兰氏阴性细菌奥奈达希瓦氏菌中能够感知和应答细胞壁损伤的双组分系统PghK/PghR及其调控的靶基因启动子P
blaA
构建一种全细胞微生物传感器。在革兰氏阴性菌中构建感知细胞壁靶向抗生素的全细胞微生物传感器尚未有报道，本专利技术为首次报道。本专利技术构建的全细胞微生物传感器能够特异性响应细胞壁靶向抗生素(如β
‑
内酰胺类、糖肽类和D
‑
环丝氨酸等)，通过双组分系统PghK/PghR进而激活由P
blaA
驱动的报告基因表达；对β
‑
内酰胺酶基因blaA进行敲除显著提升全细胞微生物传感器的灵敏度；在固体平板中该全细胞微生物传感器同样具有优良的响应性能。因此，本专利技术构建的全细胞微生物传感器能够用于细胞壁靶向抗生素的检测以及细胞壁靶向抗生素产生菌的筛选，对新型抗生素的发现具有重要意义。
[0026]其主要机理是当细胞壁靶向抗生素存在时，肽聚糖合成和水解之间的平衡被扰乱，进而引起肽聚糖损伤，而这种损伤可以被双组分信号转导系统PghK/PghR感知和响应。该双组分信号转导系统由位于细胞质膜上的组氨酸激酶PghK和位于细胞质中的应答调控蛋白PghR组成。PghK能够感知细胞壁靶向抗生素作用后产生的肽聚糖水解产物，其第508号位组氨酸残基(PghK
H508
)发生自磷酸化，并将磷酸化信号传递至PghR的第52号位天冬氨酸残基(PghR
D52
)，使得其构象发生改变，与β
‑
内酰胺酶基因blaA的启动子(P
blaA
)区结合，从而诱导blaA基因的表达。
四、附图说明：
[0027]图1是全细胞微生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种报告质粒，其特征在于：所述报告质粒是将报告基因和位于所述报告基因上游的P
blaA
启动子构建到载体质粒上得到的。2.如权利要求1所述的报告质粒，其特征在于：所述报告基因为荧光素酶基因luxCDABE、荧光蛋白基因或β
‑
半乳糖苷酶基因。3.如权利要求1所述的报告质粒，其特征在于：所述P
blaA
启动子的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。4.如权利要求1所述的报告质粒，其特征在于：所述报告质粒是将P
blaA
启动子构建于含荧光素酶基因luxCDABE的质粒上获得。5.如权利要求1所述的报告质粒，其特征在于：所述含荧光素酶基因luxCDABE的质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。6.如权利要求1所述的报告质粒，其特征在于：所述报告质粒的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。7.包含如权利要求1所述的报告质粒的全细胞微生物传感器，其特征在于：所述全细胞微生物传感器是将上述报告质粒转入blaA基因缺陷的S.oneidensis MR
‑
1菌株获得的。8.如权利要求7所述的全细胞微生物传感器，其特征在于：所述报告质粒以接合的方式转入blaA基因缺陷的Shewanella oneidensis MR
‑
1菌株。9.如权利要求8所述的全细胞微生物传感器，其特征在于：所述的接合以含有所述报告质粒的Escherichia coli WM...

【专利技术属性】
技术研发人员：音建华，余志良，朱怡铃，孟秋，朱廷恒，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：