与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子病毒学和免疫学技术领域，提供与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体及其应用，具有重链可变区VHH，所述VHH包含如下CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3，所述VHH包括FR1

【技术实现步骤摘要】
与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术属于分子病毒学和免疫学
，更具体地，本专利技术涉及一种与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是世界范围内一组极为常见的病毒，是一种嗜上皮性病毒，具有高度的宿主特异性，可诱发人类产生疣状增生乃至引发良性或恶性肿瘤，几乎所有宫颈癌病例都是由人乳头瘤病毒感染导致。全球每年宫颈癌的新发病例为52.8万。在中国已上市三种HPV疫苗(二价、四价和九价)，均可用于预防高危型HPV，但目前接种率仍较低，部分个体即使接种疫苗仍无抗病毒抗体产生，且疫苗不能治疗已获人乳头瘤病毒感染或宫颈癌等与人乳头瘤病毒有关的疾病。
[0003]在羊驼科动物体内存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体，其可变区仅由重链组成，该可变区蛋白直径小于10纳米，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体具有分子量小、穿透性强、易于表达、易于基因改造以及易于结合多个表位等优点。
[0004]纳米抗体是目前最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers在骆驼血液中发现，是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点，一是体积是普通抗体的1/ 10，因为体积小，其在动物组织体内的穿透力强，可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病；二是抗原特异性好；三是易于基因改造，方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；四是稳定性高，纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长，药效时间更持久，纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。
[0005]特异性的纳米抗体是通过筛选纳米抗体的噬菌体库来获取的。纳米抗体噬菌体文库分为免疫库和非免疫库。免疫库是使用蛋白免疫羊驼、骆驼等动物制备的。非免疫库是根据纳米抗体的恒定区与可变区的结构，保留一定的恒定区对可变区进行随机编辑制备的。当纳米抗体库的库容达到107以上时，就可以获取到针对抗原的特异性纳米抗体。非免疫库的使用节约了时间，避免了免疫动物以及采集动物血液对动物造成的伤害。
[0006]目前，临床上尚无直接针对HPV的特异性治疗药物，主要通过物理治疗及干扰素等辅助治疗，难以彻底清除体内病毒，易于复发。因此，需要研发出专门针对HPV病毒的抗体，作为宫颈癌等与HPV感染有关的疾病的治疗药物。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体及其应用，具体的提供一种与HPV结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物。
[0008]本专利技术的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与HPV蛋
白的结合能力强，能有效抑制HPV感染，该纳米抗体具有分子量小、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR区的优点，为HPV感染提供了潜在的治疗策略。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，具有重链可变区VHH，所述VHH包含如下CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3，所述VHH包括FR1
‑
4的4个框架区，所述FR1、FR2、FR3和FR4与CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。
[0010]所述FR1框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，FR2框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，FR3框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，FR4框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0011]所述重链可变区的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:8所示，其中：1
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19位为FR1框架区，29
‑
44位为FR2框架区，52
‑
74位为FR3框架区，100
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110位为FR4框架区的，FR1框架区与FR2框架区中间插入CDR1，FR2框架区与FR3框架区中间插入CDR2，FR3框架区与FR4框架区中间插入CDR3。
[0012]多核苷酸，其编码如上所述的人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示。
[0013]核酸构建体，其包含所述的多核苷酸。
[0014]表达载体，其包含所述的核酸构建体。
[0015]转化细胞，其包含所述的多核苷酸、核酸构建体或表达载体。
[0016]所述核酸构建体还包含与多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件，例如组氨酸标签、终止密码子等。
[0017]药物组合物，其含有所述的与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段和药用载体。
[0018]与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段在制备预防、治疗和/或诊断HPV感染的试剂盒或药物中的用途。
[0019]本专利技术针对人乳头瘤病毒HPV进行纳米抗体药物开发，通过抗原免疫羊驼后采集外周血、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选获得特异性结合HPV的高亲和力纳米抗体。所获得的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与HPV蛋白的结合能力强，能有效抑制HPV感染，该纳米抗体具有分子量小、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR区的优点，为HPV感染提供了潜在的治疗策略。
附图说明
[0020]一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词
“ꢀ
示例性”意为
“ꢀ
用作例子、实施例或说明性”。这里作为
“ꢀ
示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0021]图1是本专利技术实施例1的HPV16
‑
L1SDS‑PAGE鉴定结果示意图；图中：Line 1：Marker，Line2
‑
4：HPV16
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L1；图2是本专利技术实施例2的VHH片段扩增结果示意图；图中：Line 1
‑
12：从淋巴细胞中扩增获得的VHH核酸片段，Line13：Marker；
图3是本专利技术实施例3的平板检测HPV16
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VHH纳米文库库容结果图；图4是本专利技术实施例3的平板检测HPV16
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VHH纳米文库的文库丰度结果图；图5是本专利技术实施例4的HPV16
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VHH原核表达结果示意图；图中：Line 1：Marker，Line 2：16℃大肠杆菌表达上清，Line 3：16℃大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，具有重链可变区VHH，其特征在于：所述VHH包含如下CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3，所述VHH包括FR1
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4的4个框架区，所述FR1、FR2、FR3和FR4与CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。2.根据权利要求1所述的与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述FR1框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，FR2框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，FR3框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，FR4框架区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。3.根据权利要求1所述的与人乳头瘤病毒HPV特异性结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，其中：1
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19位为FR1框架区，29
‑
44位为FR2框架区...

【专利技术属性】
技术研发人员：白崇智，仲启明，王若瑜，仝立国，吉海杰，宋美卿，杨钤，贾力莉，牛艳艳，冯玛莉，郑晨，李婷钰，高炎，
申请(专利权)人：山西省中医药研究院山西省中医院，
类型：发明
国别省市：