一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1

【技术实现步骤摘要】
一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法


[0001]本专利技术涉及聚羟基脂肪酸酯合成领域，特别涉及一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法。

技术介绍

[0002]传统的石油基塑料因其降解能力差，已经造成了严重的环境污染，因此，可生物降解塑料作为石油基塑料的环保替代品具有良好的应用前景。作为可生物降解塑料中的一种，聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)是细菌合成的一种胞内聚酯，在细菌体内主要作为碳源和能源的贮藏性物质而存在，PHA具有类似于合成塑料的物化特性，以及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。PHA在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景，目前成为了塑料新材料领域的研究热点。
[0003]与传统的石油基塑料相比，目前广泛使用的细菌合成PHA的方法中底物成本高，PHA合成产量偏低；较低的产量使得后续提纯PHA的成本较高。因此，高昂的生产成本是制约PHA大规模生产应用的限制性因素。为了提高PHA的产量，利用基因工程改造现有的底盘菌又存在着基因泄露等安全风险。
[0004]因此，亟需寻找一种更安全有效、使细菌产生尽可能多地合成PHA的方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，利用该方法生成的PHA产量高，有利于降低合成成本；且生成的PHA产物纯度高，最终PHA的干重可到60％以上，产物纯度高，大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1
‑
6μmol/L的所述信号分子溶液混匀，得到混合液；将所述混合液在30
‑
35℃，200
‑
400转/分钟的条件下培养，培养结束后，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
[0007]通过上述技术方案，由于群体感应是微生物中普遍存在的现象，群体感应作为细菌间交流的“语言”，通过分泌信号分子来感知细菌密度的变化，进而调控基因的表达，从而控制细菌的群体行为。因此群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制，细菌的群体感应具有增强微生物合成PHA的潜力。
[0008]具体表现为：微生物的群体感应系统通过分泌自诱导的信号分子调控微生物的代谢活动。微生物通过扩散性信号小分子(又称为自诱导物)与转录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子从细菌细胞扩散到环境中，一旦达到一个临界浓度(或者说达到某一特定的群体密度)，这些信号分子就可诱导调节一系列目标基
因的表达，从而调控微生物的代谢活动。
[0009]进一步地，所述无机盐培养基的配方为1L去离子水加入NH4Cl 0.5
‑
0.6g，KNO
3 2.1
‑
2.17g，葡萄糖10.0
‑
11.0g，Na2HPO4·
12H2O 11.56
‑
11.74g，KH2PO
42‑
2.5mg，MgSO4·
7H2O 0.1
‑
0.2g，微量元素液0.1mL。
[0010]其中，所述微量元素液的配方(g/L)为乙二胺四乙酸二钠7
‑
7.5，FeSO4·
7H2O 2.5
‑
3，MnCl2·
4H2O 0.02
‑
0.04，Na2MoO4·
2H2O 0.2
‑
0.3，CuCl2·
2H2O0.1
‑
0.1，ZnCl
2 0.3
‑
0.5。
[0011]进一步地，所述信号分子为N
‑
酰基高丝氨酸内酯。
[0012]进一步地，所述N
‑
酰基高丝氨酸内酯为C6
‑
HSL、C8
‑
HSL、C12
‑
HSL、C16
‑
HSL中的任意一种。
[0013]优选的，所述N
‑
酰基高丝氨酸内酯为C16
‑
HSL。
[0014]进一步地，所述细菌是属于副球菌属。
[0015]进一步地，所述属于副球菌属的细菌为脱氮副球菌，所述脱氮副球菌的菌种来自美国菌种保藏中心，编号为ATCC19367。
[0016]通过上述技术方案，脱氮副球菌相比于其他细菌的优势在于其PHA的积累能力强，并且兼具合成PHA和反硝化的功能，群体感应会对其PHA的合成和反硝化功能共同产生调节作用。
[0017]进一步地，所述细菌的菌种在使用前需要进行活化处理。
[0018]进一步地，所述活化处理步骤为，将所述菌种接种至TSB培养基中培养，得到OD值为1.0的菌悬液。
[0019]进一步地，所述菌种按照1
‑
1.2％的接种量接种至TSB培养基。
[0020]进一步地，所述TSB培养基的配方(g/L)为胰酪胨17.0
‑
18.0，氯化钠4.5
‑
5.3，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0
‑
5.0，磷酸氢二钾2.0
‑
3.0，葡萄糖2.3
‑
2.6。
[0021]进一步地，所述TSB培养基用蒸馏水配制而成，之后调节pH为7.2
±
0.2，经121℃压力蒸汽灭菌后使用。
[0022]进一步地，所述菌悬液按照1
‑
1.2％的接种量接种至无机盐培养基。
[0023]进一步地，所述信号分子溶液所用的溶剂为二甲基亚砜或乙腈。
[0024]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0025]1、本申请中生成的PHA产量高，特别是当C16
‑
HSL溶液的浓度为2μmol/L时，在48小时的摇瓶实验中，能达到1.1mg/mL产量，相比于未添加信号分子C16
‑
HSL的空白组增产22％以上，有利于降低合成成本；
[0026]2、本申请中生成的PHA产物纯度高。本申请中提供的微生物方法合成PHA，最终PHA的干重可到60％以上，产物纯度高，这就大大降低了后续提纯PHA的难度和成本。
[0027]3、信号分子C16
‑
HSL可以促进PHA合成关键基因phaC的表达，因此可以大幅度促进脱氮副球菌PHA的合成。
[0028]4、信号分子C16
‑
HSL可以提升能量载体ATP和电子供体NADPH的含量，促进微生物的合成代谢，进而增产PHA。
[0029]5、信号分子C16
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，将所述细菌接种至无机盐培养基中，之后加入浓度为1
‑
6μmol/L的所述信号分子溶液混匀，得到混合液；将所述混合液在30
‑
35℃，200
‑
400转/分钟的条件下培养，培养结束后，得到所述聚羟基脂肪酸酯。2.根据权利要求1所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述信号分子为N
‑
酰基高丝氨酸内酯。3.根据权利要求2所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述N
‑
酰基高丝氨酸内酯为C6
‑
HSL、C8
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HSL、C12
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HSL、C16
‑
HSL中的任意一种。4.根据权利要求1所述的一种基于群体感应信号分子增强细菌合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述细菌是属于副球菌属。5.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯骁驰，徐玉洁，石弘弢，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学深圳，
类型：发明
国别省市：