抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，提供了SCARNA2作为靶向标志物的应用，也提供了抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。实验结果显示，抑制SCARNA2基因表达的shRNA能促进肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，进而提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。进而提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。进而提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。

【技术实现步骤摘要】
抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，涉及SCARNA2作为靶向标志物的应用，具体涉及抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。

技术介绍

[0002]直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，总生存率为50％。根据2022年全球癌症普查的统计数据，直肠癌是全球第三大最常见的恶性肿瘤。近50年来，世界上很多国家的直肠癌发病率和死亡率呈急剧上升趋势。根据世界卫生组织的数据，直肠癌目前是全世界癌症死因的二名，约占全部恶性肿瘤的19％。全世界每年的新增病例超过120万。目前已知直肠癌的发生有多个危险因素，如吸烟，肥胖，熬夜，久坐，肠道息肉和人体自身免疫力下降等因素，存在危险因素的个体患直肠癌的概率会增加。相应的预防直肠癌的发生就要减少危险因素暴露，如定期切除肠道息肉，减少吸烟，减肥，经常运动等。直肠癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。目前直肠癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是是治疗直肠癌的重要手段，但很多患者出现辐射抵抗，治疗效果不如人意。肿瘤对辐射不敏感或对辐射产生抗拒性，是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主要原因之一。
[0003]小Cajal体特异性RNA2(Small Cajal Body
‑
Specific RNA 2，SCARNA2)是一种定位于核Cajal体的核仁内小非编码RNA。这种小非编码RNA大小在60
‑
170个核苷酸之间，可以指导其它RNA的化学修饰，尤其是在核糖体和小核RNA(snRNA)中发挥作用。snoRNA分为两个不同的家族，box C/D家族，催化RNA甲基化，box H/ACA家族，催化假尿苷化。这两个家族都与一组特定的蛋白质结合形成snoRNP(小核仁核糖核蛋白)，其中RNA提供靶向特异性。box C/D和H/ACA snoRNA的一个分支，称为SCARNA，定位于核Cajal体，在那里它们有助于剪接小体snRNA的修饰。大量研究表明，SCARNA是一种肿瘤抑制基因；且在多种人类肿瘤中表达下调或缺失，但在放疗耐受肿瘤中高表达；同时研究发现，SCARNA不仅能够抑制肿瘤发生，而且能够抑制肿瘤转移。这些研究表明，SCARNA与肿瘤的发生发展密切相关。
[0004]目前基于SCARNA2和肿瘤之间关系的研究主要集中于SCARNA2通过竞争性结合minRNA来影响细胞生长、细胞周期和侵袭或者影响肿瘤细胞的化学抗性等方面。抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内外至今无人报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术依托上述研究进行，目的在于提供SCARNA2作为靶向标志物的应用，也在于提供抑制SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的第一方面，提供了抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
[0007]优选的，该抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是通过shRNA敲低SCARNA2基因表
达的试剂；进一步优选为含有shRNA的重组表达载体或转染细胞；更优选为靶向SCARNA2基因的重组慢病毒质粒。
[0008]优选的，抑制SCARNA2基因表达的shRNA包括正义链和反义链，正义链和反义链的核苷酸序列分别如下所示：
[0009]正义链：5
’‑
CACCGCATCAGGCCCACACC(SEQ ID NO.1)；
[0010]反义链：5
’‑
TGCGGGCTGCCGGTGGCGTA(SEQ ID NO.2)；
[0011]优选的，所述的肿瘤放疗增敏药物促进肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。
[0012]进一步的，肿瘤为结直肠癌、肝癌或肺癌，优选为结直肠癌。所述的肿瘤放疗增敏药物是用于直肠癌的放疗增敏药物。
[0013]本专利技术将SCARNA2shRNA及NC序列转入直肠癌细胞HCT116/HT29中，72h应用Western blot对直肠癌细胞HCT116/HT29的SCARNA2蛋白进行检测。结果发现：SCARNA2shRNA可以有效抑制HCT116/HT29细胞中高度表达的SCARNA2蛋白。
[0014]进一步，对正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列的HCT116/HT29细胞给予不同剂量(0、2、4、8Gy)的
60
Coγ射线照射，然后继续培养2周后采用克隆形成率检测细胞生长和增殖，结果显示：转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞随着照射剂量的增加，细胞死亡率明显高于正常HCT116/HT29细胞和转染NC质粒的HCT116/HT29细胞。同时，本专利技术给予两种细胞8Gy的
60
Coγ射线照射，然后继续培养24h后采用AnnexinV
‑
FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示：转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞的凋亡率照后明显高于正常HCT116/HT29细胞组及转染NC组。
[0015]接下来，本专利技术将两种细胞以1
×
105个/ml密度接种于六孔板，加2ml 1640培养基培养；第二天给予两种细胞8Gy的
60
Coγ射线照射，分别在0h、8h、12h及24h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用0.3ml PBS溶液重新悬浮细胞，然后缓慢加入4℃预冷的无水酒精0.7ml，
‑
20℃冰箱过夜；检测前进行PI单染：1000rpm离心5min，去上液；加PBS清洗一遍，加100μl 5mg/ml RNA酶溶液，37℃保温30min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液(100μg/ml)避光染色30min；应用FCM测细胞周期：用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行细胞周期分析，氩离子激发PI荧光，激发光波长为488nm，用620nm波长滤器检测对数红色荧光，收集数据待分析。结果显示，抑制SCARNA2基因在照射后促进HCT116/HT29细胞发生了更明显的G2期细胞阻滞。
[0016]最后，本专利技术将两种细胞以1
×
105个/ml密度接种于六孔板，加2ml 1640培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予两种细胞8Gy的
60
Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用无Ca
2+
、Mg
2+
的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2
×
104个细胞/ml，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是通过shRNA敲低SCARNA2基因表达的试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过shRNA敲低SCARNA2基因表达的试剂包括含有shRNA的重组表达载体或转染细胞。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是靶向SCARNA2基因的重组慢病毒质粒。5.根据权利要求2所述的应用，所述shRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤放疗增敏药物为促进肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞G2期细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈媛媛，马盛哲，万志杰，沈辉，杜志鹏，曹堃，刘婷婷，杨彦勇，高福，王航，尹基忠，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：