一种胰蛋白酶稳定剂、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种胰蛋白酶稳定剂、制备方法及其应用。本发明专利技术所述的胰蛋白酶稳定剂为摩尔比为1:7～9的海藻糖与甜菜碱制备的低共熔溶剂。该胰蛋白酶稳定剂可以在低温、高温和强酸强碱条件下维持胰蛋白酶的活力。酸强碱条件下维持胰蛋白酶的活力。酸强碱条件下维持胰蛋白酶的活力。

【技术实现步骤摘要】
一种胰蛋白酶稳定剂、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种蛋白酶稳定剂及其应用，特别涉及一种胰蛋白酶稳定剂、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]酶是一种来源于生物的具有催化能力的生物催化剂。酶从本质上分类主要可以分为蛋白酶和核酶。酶的主要催化特征包括了高催化效率、作用温和以及易失活等。其中蛋白酶在工业、食品、化妆品和医药等方面有较多的应用，在使用蛋白酶时要充分考虑其最适温度和最适pH等环境条件，以实现最大催化效率。除此以外，蛋白酶在强酸、强碱、高离子强度或者高温条件下容易失活，极大的降低了经济效益，因此需要通过物理化学方法提高蛋白酶的稳定性。目前提高蛋白酶稳定性的方法主要有化学修饰、固定化、基因工程以及添加稳定剂等，其中，相比于化学方法，添加稳定剂操作简单，可以在很大程度上降低试验成本，且有效的提高蛋白酶的稳定性。有研究者证实了直链烷基苯磺酸钠(LAS)、α
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烯基磺酸钠(AOS)以及烷基多糖苷(APG12～14)对蛋白酶的稳定效果较好，但是储存环境不能高于35℃。
[0003]低共熔溶剂(Deep eutectic solvent，DES)是指在较低温度下，按一定的比例把两种或多种组分进行简单的物理混合后，氢键供体(Hydrogen bond donor，HBD)和氢键受体(Hydrogen bond acceptor，HBA)之间由于氢键作用而形成的均匀透明的液态熔融盐。HBD一般是具有羧基、羟基和氨基的物质，而HBA一般是以季铵盐为代表的一些物质。低共熔溶剂中氢键供体和氢键受体之间的相互作用可以抑制敏感条件下阴阳离子交换，降低不稳定物质的降解速率，具有与离子液体(Ionic liquid，IL)相似的不易挥发，高沸点等性质。但是相对常规IL而言，DES的生物兼容性更好，降解能力更优及可持续发展性能更好，且其化学性质稳定，制备过程简单，价格低廉。自然界中可能存在类似DES的物质，如一些氨基酸、有机酸、糖或胆碱衍生物等存在于各种生物体中的许多丰富的初级代谢物混合在一起时，可以形成天然低共熔溶剂(Natural deep eutectic solvent，NADES)。因NADES的组分为天然产物，所以NADES的毒性明显低于DES，且在经济和环境角度上，NADES的生物降解性、可持续性及制备成本均优于DES。常测定的性质有凝固点和熔点、黏度、电导率、表面张力、溶解性等。
[0004]NADES提供了温和，氢键的环境，使得其中蛋白质可能保持稳定和功能。其中水在蛋白质活性位点周围形成溶剂化层，使其能够部分或完全保留其天然构象。除此以外，用于制备NADES的前体物质的不同组合也打开了调整溶剂特性的可能性，其目标是合理设计特定应用的溶剂。因此，可以通过溶剂组合物的变化进行修饰和优化蛋白质微环境。而酶活性受到溶剂影响更为敏感，如Knudsen等人证明了与水缓冲溶液相比，高粱蜀黍苷生物合成酶在NADES中表现出更高的稳定性。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种基于天然低共熔溶剂的胰蛋白酶稳定剂、制备方法及其应用。该稳定剂可以在低温、高温和强酸强碱条件下维持胰蛋白酶的活力。
[0006]技术方案：本专利技术所述的胰蛋白酶稳定剂为摩尔比为1:7～9的海藻糖与甜菜碱制备的天然低共熔溶剂。
[0007]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述天然低共熔溶剂通过加热搅拌的方法制备而成。
[0008]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述海藻糖与甜菜碱的摩尔比为1:7。
[0009]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述加热的温度为75～85℃。
[0010]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述天然低共熔溶剂中，海藻糖与甜菜碱的体积不高于50％。
[0011]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述天然低共熔溶剂中，海藻糖与甜菜碱的体积浓度为50％。
[0012]本专利技术所述的胰蛋白酶稳定剂的制备方法，包括以下步骤：海藻糖与甜菜碱搅拌、加热，形成在室温下稳定存在的透明液体，并且加入水稀释，得到胰蛋白酶稳定剂。
[0013]作为本专利技术的一种优选实施方式，加入水的体积与所述透明液体的体积比为1:1。
[0014]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述加热的温度为75～85℃。
[0015]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述加热的温度为80℃。
[0016]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述搅拌的速度为500～700rmp。
[0017]作为本专利技术的一种优选实施方式，所述搅拌的速度为600rmp。
[0018]本专利技术所述的低共熔溶剂在胰蛋白酶稳定剂中的应用。
[0019]有益效果：(1)本专利技术以天然来源的海藻糖为氢键供体，进行氢键受体的筛选，最终筛选制备出以甜菜碱为氢键受体的NADES，并且利用NADES体系稳定不同环境下的胰蛋白酶，结果表明海藻糖和甜菜碱制备的NADES对胰蛋白酶在低温、高温和强酸强碱条件下的活力都有稳定作用，并且可以促进蛋白质结构趋向折叠，从而在结构上提高其稳定性，进一步表明NADES能够稳定胰蛋白酶活力主要是由于NADES中广泛的氢键网络，而不是组分的累加作用；(2)相比于其他蛋白质稳定剂来说，NADES解决了蛋白酶在强酸、强碱以及高温条件下容易失活的问题，使得胰蛋白酶在较多情况下仍能发挥活性，提高酶促反应效率，此外，本专利技术制备的NADES来源于天然物质，毒性低，成本低，制备方法简单，并且能够极大程度的维持胰蛋白酶的活力。
附图说明
[0020]图1为不同HBA和HBD制备NADES的产品图片，其中，A图中从左到右依次为海藻糖和精氨酸、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸摩尔比为2:1、1:1和1:2时制备NADES的图片，B图为海藻糖和甜菜碱制备NADES的图片，B图右下角从左至右分别为海藻糖和甜菜碱摩尔比为1:3、1:5、1:7和1:9制备的NADES的图片；
[0021]图2为海藻糖
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甜菜碱NADES的红外吸收图谱；
[0022]图3为NADES 1
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7的1H
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NMR谱图；
[0023]图4为NADES 1
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7的DSC图；
[0024]图5为NADES在不同浓度下的粘度；
[0025]图6为胰蛋白酶在0％、10％、20％、30％、40％、50％(v/v)NADES中的相对酶活力；
[0026]图7为胰蛋白酶在不同温度(
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20℃,25℃,37℃,60℃)下NADES 1
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7中的相对酶活力；
[0027]图8为胰蛋白酶在不同pH条件下，不含及含有50％(v/v)NADES体系中的相对酶活力；
[0028]图9为胰蛋白酶在25℃条件下，不含和含有50％(v/v)NADES体系中随储存时间的酶活力变化；
[0029]图10为胰蛋白酶在37℃条件下，不含和含有50％(v/v)NADES体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胰蛋白酶稳定剂，其特征在于，所述胰蛋白酶稳定剂为摩尔比为1:7～9的海藻糖与甜菜碱制备的低共熔溶剂。2.根据权利要求1所述的胰蛋白酶稳定剂，其特征在于，所述低共溶剂通过加热搅拌的方法制备而成。3.根据权利要求1所述的胰蛋白酶稳定剂，其特征在于，所述海藻糖与甜菜碱的摩尔比为1:7。4.根据权利要求2所述的胰蛋白酶稳定剂，其特征在于，所述加热的温度为75～85℃。5.根据权利要求1所述的胰蛋白酶稳定剂，其特征在于，所述低共熔溶剂中，海藻糖与甜菜碱的体积浓度不高于50％。6.根据权利要求5所述的胰蛋白酶稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晨光，于钰，于晓波，田雨，丁松，王大卫，
申请(专利权)人：江苏优度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：