一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法。基于拉曼光谱快速检测单个活细胞内麦角硫因。具体操作为：获取待测活体细胞液，洗涤，调整菌悬液浓度，将所得菌悬液加入至样品检测池，利用显微镜找到溶液中的细胞，用激光照射细胞并获得该细胞的拉曼光谱，对所得拉曼光谱数据进行背景去除、光滑处理、基线校准和归一化处理，检测拉曼光谱特征峰，若细胞的拉曼光谱中存在1210cm

【技术实现步骤摘要】
一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法


[0001]本专利技术属于生物化学技术和分析化学领域，具体涉及一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法。

技术介绍

[0002]麦角硫因(Ergothioneine,EGT)分子式为C9H
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N3O2S，分子量为229.3，易溶于水，不易分解，是一种稀有的天然手性氨基酸。麦角硫因是一种安全、无毒的天然抗氧化剂，具有缓解炎症、清除自由基、解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。在器官移植、细胞保存、食品饮料、化妆品、动物饲料等领域具有广泛的用途和市场前景。已知天然的麦角硫因主要由放线菌、蓝细菌和蘑菇等有限的微生物类群产生(Hanetal.,2021)。动物和人体内肠道虽然具有微生物菌群，但目前尚无确切证据表明肠道微生物能够合成麦角硫因，动物或人体的红细胞、骨髓、肝脏、肾等组织中的麦角硫因通过外源摄取和积累获得(CheahandHalliwell2021；Eyetal.,2007)。据报道，在一些病原菌中，例如伯克氏菌(Burkholderia)(Gamage etal.,2018)、结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis)(Cummingetal.,2018)和烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)(Sheridanetal.,2016)也能够合成麦角硫因，用于抵抗宿主防御或增强对抗生素的耐药性(CheahandHalliwell2021)。通过化学合成法和生物合成法两种方法获取麦角硫因。其中生物合成具有发酵周期短、产率高、成本低等优点(陈佳敏etal.,2022)。目前，通过大肠杆菌、酿酒酵母、曲霉等基因重组微生物可以发酵生产麦角硫因。
[0003]细胞中麦角硫因的检测对产麦角硫因微生物的种质资源挖掘、育种和重组菌株中高产细胞筛选等研究以及工业应用等至关重要。目前关于麦角硫因的检测方法主要有以下方法：(1)分光光度计法，即在碱性介质中利用铜离子介导硫醇氧化，随后在pH1左右条件下与2,2'
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二硫代二吡啶(2,2'
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Dipyridyldisulfide)迅速反应(Carlssonetal.,1974)；(2)薄层色谱法，即提取的样品放置于填充有吸附剂体系的玻璃板中，利用化合物与吸附剂的吸附度的差异区分目标化合物(Kanekoetal.,1980)；(3)高效毛细管电泳法，将待测样品添加至毛细管中，在电场作用下，因不同化学分子大小、所带电荷性质和多少等差异使不同组分按一定速度迁移，在不同化学组分迁移的过程中通过激光诱导荧光检测不同组分(Sotgiaetal.,2013)；(4)高效液相色谱法(High performanceliquidchromatographv，HPLC)(Sotgiaetal.,2013；vanderHoeketal.,2022)，目前HPLC方法是检测麦角硫因的主流方法。首先需要破损细胞或提取发酵液，经过回流提取法/酶解提取法/超声微波联合提取法等提取细胞中或发酵液中麦角硫因粗品，最后浓缩得到待测样品，以甲醇或乙腈
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水等作为流动相，样品经过亲水柱和UV检测器(254～257nm波长)检测样品中是否具有麦角硫因及其含量。然而该检测方法需要待测样品的复杂准备过程，破损细胞，对检测过程中所需试剂的纯度要求高，不适用于检测单个细胞内麦角硫因的变化；(5)与HPLC结合的联用的电感耦合等离子串联质谱(HPLC
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ICP
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MS)，首先收集细胞裂解液，去除细胞碎片和蛋白质等，裂解液经液氮冻融后按一定比例加入TCEP和IAM溶液，经过2小时的室温孵育后通过分子筛
等去除裂解液中的蛋白质，滤液加入HPLC/ICP
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MS，利用8800
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ICP
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QQQ
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MS系统进行分析，例如检测血红细胞中麦角硫因的条件设气体温度500度流速65，喷雾电压3500V，毛细管温度300度，核质比m/z扫描范围170
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600(Kroepfletal.,2019)；(6)与HPLC联用的还有LC
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MS/MS三重四极杆串联质谱，用氮气雾化样品，在520度下引入检测腔，通过正电离子喷雾进行分析麦角硫因的最佳碰撞能量，前体和产物离子在通过质谱仪时使用MRM进行监测，最后用分析软件分析数据(Wangetal.,2013)。以上检测技术均需要前期繁杂的样品准备工作，细胞的破损，且需要大量样本，无法应用于单细胞麦角硫因的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法。本专利技术的方法样品准备简单，需要样品量少，无需细胞破损，检测时间短，可以实现单个活细胞中麦角硫因的检测。
[0005]本专利技术所提供的快速无损检测细胞中麦角硫因的方法，为基于拉曼光谱快速检测细胞内麦角硫因。
[0006]所述细胞为激光照射范围内的单个或多个细胞。
[0007]在本专利技术的一个实施方式中，所述细胞为在Q期(静息期)的野生型WT，EGT1基因突变株egt1Δ和EGT1基因回补株PEGT1
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EGT1的新生隐球菌细胞。
[0008]在研究条件致病真菌的毒力及感染机制中，我们发现新生隐球菌能够形成休眠状态，休眠状态细胞可以很好的抵制宿主的免疫系统的清除。代谢组研究首次发现该类休眠细胞可以高效地表达麦角硫因。细胞内麦角硫因的检测通常采用HPLC方法检测，而单细胞麦角硫因的快速无损检测是极具挑战的，目前尚无快速无损的单细胞内麦角硫因检测技术的报道。为了更加高效快速无损地检测细胞内麦角硫因，我们采用了可以在单细胞水平进行检测的振动光谱(拉曼光谱)检测技术。
[0009]本专利技术的快速无损检测细胞中麦角硫因的方法，包括如下步骤：
[0010]获取待测活体细胞液，洗涤，调整菌悬液浓度，将所得菌悬液加入至样品检测池，利用显微镜找到溶液中的细胞，用激光照射细胞，并获得该细胞的拉曼光谱，若细胞的拉曼光谱存在1210cm
‑1和1507cm
‑1的标识峰，则判定待测活体细胞中含有麦角硫因，反之，则判定待测活体细胞中不含麦角硫因。
[0011]进一步地，若细胞的拉曼光谱中1210cm
‑1和1507cm
‑1的拉曼特征峰强度高，则判定活体细胞中的麦角硫因含量较高。
[0012]所述细胞的拉曼光谱中1210cm
‑1和1507cm
‑1的拉曼标识峰受仪器设备的分辨率限制，其标识峰可有1
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2cm
‑1的偏移。
[0013]所述激光照射的细胞数目为激光照射范围内的单个细胞或多个细胞。
[0014]上述方法中，所述洗涤为对获取的待测活体细胞液中的细胞用氯化钠溶液或细胞等渗透压溶液进行洗涤，所述洗涤进行多次，具体可为2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速无损检测细胞中麦角硫因的方法，为基于拉曼光谱快速检测细胞内麦角硫因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述快速无损检测细胞中麦角硫因的方法，包括如下步骤：获取待测活体细胞液，洗涤，调整菌悬液浓度，将所得菌悬液加入至样品检测池，利用显微镜找到溶液中的细胞，用激光照射细胞，并获得该细胞的拉曼光谱，若细胞的拉曼光谱存在1210cm
‑1和1507cm
‑1的标识峰，则判定待测活体细胞中含有麦角硫因，反之，则判定待测活体细胞中不含麦角硫因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：若细胞的拉曼光谱中1210cm
‑1和1507cm
‑1的拉曼标识峰强度高，则判定待测活体细胞中的麦角硫因含量较高。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：细胞的拉曼光谱中1210cm
‑1和1507cm
‑1的拉曼标识峰受仪器设备的分辨率限制，其标识峰可有1
‑
2cm
‑1的偏移。5.根据权利要求2
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4中任一项所述的方法，其特征在于：所述激光照射的细胞数目为激光照射范围内的单个细胞或多个细胞。6.根据权利要求2
‑
5...

【专利技术属性】
技术研发人员：付钰，王琳淇，卢维来，仇昊宁，谢语嫣，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：