基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用。具体地公开了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，所述特异序列标签为LC1和/或LC2，所述LC1是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2是核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA。本发明专利技术利用生物信息学分析方法鉴定、筛选获得类鼻疽菌特异序列标签LC1和LC2，并以此为基础结合RPA

【技术实现步骤摘要】
基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及基于特异序列标签的类鼻疽伯克霍尔德菌的检测方法与应用。

技术介绍

[0002]类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)简称为类鼻疽菌，由于具有侵入和在细胞内存活的能力而对人类致病，主要引起类鼻疽(Melioidosis)，曾在东南亚和澳大利亚北部地区流行，可通过皮肤接触、吸入或食入等途径发生感染。类鼻疽患者病死率高，临床表现为多发性脓肿、难治性肺炎及致死性败血症，严重的败血症性类鼻疽在24～48小时内就可导致患者死亡，世界范围内类鼻疽病例逐年的增加使之成为一项严重的公共卫生问题。
[0003]针对类鼻疽菌开发出特异、快速、灵敏的检测方法对类鼻疽防治，挽救患者生命具有积极作用。针对环境中类鼻疽菌检测的“金标准”是基于土壤和水体的微生物分离培养，而在临床中对类鼻疽的检测则是血液培养分离鉴定，但这些方法耗时耗力且需要专业人员操作。目前，分子鉴定如聚合酶链式反应技术(PCR)已成为病原细菌检测的常规技术方法。然而，类鼻疽菌与同属的姊妹物种(如鼻疽伯克霍尔德菌)有很大的相似性，因此很难鉴别。也有一些关于采用染色体上的特异序列来区分这两种菌，但实验室采用的菌株数目太少，引物特异性验证有限。
[0004]随着高通量测序技术的快速发展，使得短时间内能够获得大量类鼻疽相关基因组数据。这些海量数据使得通过生物信息学分析方法获得类鼻疽菌的核心基因组特异序列标签成为可能，与新兴的RPA
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CRISPR快速检测技术结合可快速准确的对类鼻疽菌和类鼻疽病进行鉴定与诊断，目前在国内外还未见报道。
[0005]鉴于目前的检测方法仍不能满足临床检测的需求，敏感性和特异性还有待进一步提高，因此开发一种快速便捷、特异性好，灵敏度高的类鼻疽菌的检测方法能够为类鼻疽病的防控提供可靠、有效的技术保障。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是如何快速、特异和/或灵敏地检测类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，所述特异序列标签可为LC1和/或LC2，所述LC1可为核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2可为核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA。
[0008]所述特异序列标签为本专利技术鉴定筛选得到的含有PAM序列(TTTN)的类鼻疽菌2条染色体上的特异序列标签，分别命名为LC1和LC2，LC1和LC2是能够用来检测类鼻疽菌存在和能区分其与其他病原菌的特异性核酸序列。
[0009]类鼻疽菌两条染色体，一条大染色体，与细菌基本的营养代谢活动相关；一条小染色体，与细菌的耐药、毒力和环境适应性相关。
[0010]本专利技术还提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有由引物LC1
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F2和引物LC1
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R3组成的引物对、LC1
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crRNA
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1和ssDNA reporter，或含有由引物LC2
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F4和引物LC2
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R4组成的引物对、LC2
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crRNA
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2和ssDNA reporter，或含有由引物LC1
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F2、引物LC1
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R3、引物LC2
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F4和引物LC2
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R4组成的引物组合物、LC1
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crRNA
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1、LC2
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crRNA
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2和ssDNA reporter；所述引物LC1
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F2为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；所述引物LC1
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R3为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；所述引物LC2
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F4为SEQ ID No.14所示的单链DNA分子；所述引物LC2
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R4为SEQ ID No.18所示的单链DNA分子；所述LC1
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crRNA
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1为SEQ ID No.19所示的RNA分子，所述LC2
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crRNA
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2为SEQ ID No.22所示的RNA分子。
[0011]SEQ ID No.19的第1
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21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.19的第22
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45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC1，SEQ ID No.1)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC1
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F2和引物LC1
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R3)的扩增产物。
[0012]SEQ ID No.22的第1
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21位为用于与Cas12a蛋白结合的锚定序列，SEQ ID No.22的第22
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45位为靶向类鼻疽菌靶标序列(特异序列标签LC2，SEQ ID No.2)的向导序列，用于结合RPA引物对(引物LC2
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F4和引物LC2
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R4)的扩增产物。
[0013]进一步地，所述ssDNA reporter的核苷酸序列可如SEQ ID No.23所示。
[0014]所述ssDNA reporter为报告DNA，所述报告DNA为具有信号报告功能的DNA分子，当所述DNA分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。所述阳性信号可为荧光信号。在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
[0015]所述报告DNA可为单链DNA(ssDNA)。
[0016]在本专利技术的一个实施方案中，所述ssDNA的核苷酸序列可为：
[0017]FAM
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CCCCCCCCCCCC
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BHQ1(SEQ ID No.23)，由上海生工生物有限公司合成。
[0018]进一步地，所述试剂或试剂盒还可包括Cas12a蛋白。
[0019]进一步地，所述Cas12a蛋白可独立存在或与本专利技术所述的crRNA以复合物的形式存在。
[0020]进一步地，所述Cas12a蛋白可为LbCas12a蛋白。
[0021]所述引物LC1
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F2和LC2
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F4为正向引物(上游引物)，所述引物LC1
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R3和LC2
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R4为反向引物(下游引物)。
[0022]所述正向引物LC1
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F2(SEQ ID No.4)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的特异序列标签，其特征在于，所述特异序列标签为LC1和/或LC2，所述LC1是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA，所述LC2是核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA。2.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒含有由引物LC1
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F2和引物LC1
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R3组成的引物对、LC1
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crRNA
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1和ssDNA reporter，或含有由引物LC2
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F4和引物LC2
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R4组成的引物对、LC2
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crRNA
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2和ssDNA reporter，或含有由引物LC1
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F2、引物LC1
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R3、引物LC2
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F4和引物LC2
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R4组成的引物组合物、LC1
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crRNA
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1、LC2
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crRNA
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2和ssDNA reporter；所述引物LC1
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F2为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子；所述引物LC1
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R3为SEQ ID No.9所示的单链DNA分子；所述引物LC2
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F4为SEQ ID No.14所示的单链DNA分子；所述引物LC2
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R4为SEQ ID No.18所示的单链DNA分子；所述LC1
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crRNA
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1为SEQ ID No.19所示的RNA分子，所述LC2
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crRNA
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2为SEQ ID No.22所示的RNA分子。3.根据权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述ssDNA reporter的核苷酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁媛，张湘莉兰，张嘉鑫，徐健皓，袁兵，王景林，崔玉军，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：