一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法技术

本发明专利技术适用于有机化学领域，提供了一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，制备若干个筛选平板；菌种活化：将需要进行筛选的多种或多支霉菌菌株分别接种于筛选平板中，恒温恒湿培养后进行活化；待筛选霉菌孢子悬液的制备：将活化完成的霉菌培养斜面，接种针刮取霉菌孢子，接入无菌生理盐水中悬浮，并梯度稀释，制备霉菌孢子悬液；待筛选霉菌菌悬液的接种：将制备的待筛选霉菌孢子悬液涂布到定向筛选平板中，然后置于恒温恒湿培养箱中培养；待筛选霉菌的生长速度和产葡萄糖酸能力的筛选；观察筛选平板上单菌落周围培养基的变色情况。借此，本发明专利技术方便操作、过程快速、准确率高、工作量小以及成本低的优点。工作量小以及成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法


[0001]本专利技术涉及有机化学领域，尤其涉及一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法。

技术介绍

[0002]葡萄糖酸作为一种不易挥发，无毒性且不会腐蚀的温和有机酸，葡萄糖酸及其衍生物被广泛应用于食品、医药、建筑等诸多领域。不同的葡萄糖酸盐有不同的应用。例如葡萄糖酸钠可以作为缓凝剂应用在建筑行业中，显著延缓混凝土的初凝和终凝时间。葡萄糖酸钠还可以应用在食品行业，代替食盐，改善呈味，调节酸碱度。此外，葡萄糖酸钠还可以用做钢铁表面清洗剂，具有优异的阻蚀缓垢的作用。随着葡萄糖酸及其衍生物的广泛应用，葡萄糖酸的市场需求日益增长，葡萄糖酸的工业化生产也受到越来越多的关注。葡萄糖酸的生产方式有三种，化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法由于其副产物多，反应过程不易控制，在工业化生产中很少采用。酶催化法不需要菌种，操作简便，但是酶制剂高昂的价格一直限制着酶催化法的应用。当前，工业化生产葡萄糖酸的主要方式是微生物发酵法。
[0003]目前，微生物发酵法生产葡萄糖酸的工艺已经比较成熟，可以用于生产葡萄糖酸的微生物种类很多，其中，使用最为普遍，研究最广泛的是黑曲霉。在工业生产中，菌株的使用需要连续的传代。在菌种的连续传代过程中，由于菌株自发突变的存在，不可避免的会出现菌种的衰退，原有优良生产性状的劣化，例如菌种生长缓慢，目标产物产量降低，衰亡期提前等。为了防止菌株的衰退影响工业生产的效率，需要对菌种进行复壮，即定期对菌株进行纯种分离和生产性能的测定，筛选出未衰退的优良菌株。菌株经纯种分离后会得到大量的纯种菌株，必须经过生产性能的测定，筛选后方能用于生产。生产性能的测定包括菌株生长速度的测定和产葡萄糖酸能力的测定。菌株生产速度快，发酵后期短，能源消耗少，进而生产成本低。菌株产葡萄糖酸能力强，产品产出率高，生产效益好。因此，复壮中必须筛选生长速度快且产葡萄糖酸能力强的菌株用于工业化生产。
[0004]目前，葡萄糖酸生产企业菌种复壮多采用摇瓶法筛选，即菌株经纯种分离后获得大量的纯种菌株分别进行摇瓶发酵培养，培养结束后，测定菌体量及葡萄糖酸含量。整个摇瓶筛选的过程中培养原料使用量大，耗时长，菌体量和葡萄糖酸含量的测定过程繁琐，且误差较大。
[0005]综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

技术实现思路

[0006]针对上述的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，其方便操作、过程快速、准确率高、工作量小以及成本低的优点。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，包括以下步骤：（1）制备若干个筛选平板待用，分别用作普通筛选平板和定向筛选平板，所有的筛
选平板皆设有一个霉菌培养斜面；（2）菌种活化：将需要进行筛选的多种或多支霉菌菌株分别接种于步骤（1）制备的普通筛选平板中，恒温恒湿培养后进行活化；（3）待筛选霉菌孢子悬液的制备：将步骤（2）中活化完成的普通筛选平板的霉菌培养斜面，接种针刮取霉菌孢子，接入无菌生理盐水中悬浮，并梯度稀释，制备霉菌孢子悬液；（4）待筛选霉菌菌悬液的接种：将步骤（3）中制备的待筛选霉菌孢子悬液涂布到步骤（1）中制备的定向筛选平板中，然后置于恒温恒湿培养箱中培养；（5）待筛选霉菌的生长速度和产葡萄糖酸能力的筛选：上述步骤（4）中的培养前期，观察定向筛选平板上单菌落周围培养基的变色情况。
[0008]进一步地，步骤（1）中的制备的所有的筛选平板的主要步骤皆为配置PDA培养基。
[0009]进一步地，配置PDA培养基所需原料包括：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
[0010]进一步地，步骤（1）中，PDA培养基的配置方法为：将去皮200g马铃薯切块、煮熟处理，再用纱布过滤，得到的滤液加入20g葡萄糖、15g琼脂粉和1000ml蒸馏水。
[0011]进一步地，步骤（1）中，制备定向筛选平板具体包括：琼脂粉融化后，加入筛选指示剂，指示剂配方为碳酸钙3g和5%溴甲酚绿水溶液2ml，然后在121℃环境下持续25min进行灭菌处理，最后倒入无菌干燥的培养皿中，制备试管斜面，制成定向筛选平板。
[0012]进一步地，步骤（2）中，菌株活化培养条件为：恒温恒湿培养箱温度在28℃
‑
32℃之间，湿度在45
‑
55%之间，培养60h以上。
[0013]进一步地，步骤（3）中，将制备得到霉菌孢子悬液的孢子浓度控制在＜102个/ml。
[0014]进一步地，步骤（4）中，恒温恒湿培养箱内的环境为：温度在28℃
‑
32℃之间，湿度在45
‑
55%之间；筛选平板在培养箱内培养72h以上。
[0015]进一步地，根据单菌落周围变色圈出现的时间确定各霉菌菌株的生长情况，变色圈出现的越早，说明菌株生长越快；待培养完成后，量取筛选平板上各单菌落周围形成的透明圈直径，根据透明圈直径确定各霉菌菌株产葡萄糖酸的能力的大小，透明圈越大，说明该霉菌菌株产葡萄糖酸的能力越大。
[0016]本专利技术的目的在于提供一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，与现有的技术方法相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术设计的定向筛选平板中，同时加入碳酸钙和溴甲酚绿作为筛选指示剂。霉菌生长过程中产生的葡萄糖酸会使溴甲酚绿由蓝色变为黄色，显色明显，易于观察，且在培养初期，霉菌开始产葡萄糖酸即可使培养基发生明显变色，可以明确霉菌生长速度及产酸时间点，但变色圈的边缘不够整齐，给其直径的测量带来误差，不利于霉菌产葡萄糖酸积累量的确定。所以在本专利技术设计的定向筛选平板中同时加入碳酸钙。在培养后期，霉菌产葡萄糖酸积累到一定量后霉菌单菌落周围会形成一个透明圈，透明圈形状规则，边缘整齐，方便测量其直径，进而定量确定该霉菌菌株产葡萄糖酸能力。透明圈直径越大，说明该霉菌菌株产葡萄糖酸能力越大。
[0017]2、本专利技术中设计的定向筛选平板，既可以显示菌体生长速度，也可以明确其产葡萄糖酸能力，使筛选过程简便，快速，且筛选全面。通过本专利技术中设计的定向筛选平板，可以快速筛选出生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株。
[0018]3、本专利技术的方法可以在菌种诱变后，代替摇瓶筛选方法，有效减少诱变菌株的筛选工作量和筛选成本，同时节约时间，增加筛选效率。
具体实施方式
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0020]本专利技术提供了一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，下面通过具体实施例来进一步说明。实施例仅用于本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0021]实施例1：一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，即采用定向筛选平板法筛选生长迅速且高产葡萄糖酸黑曲霉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备若干个筛选平板待用，分别用作普通筛选平板和定向筛选平板，所有的筛选平板皆设有一个霉菌培养斜面；（2）菌种活化：将需要进行筛选的多种或多支霉菌菌株分别接种于步骤（1）制备的普通筛选平板中，恒温恒湿培养后进行活化；（3）待筛选霉菌孢子悬液的制备：将步骤（2）中活化完成的普通筛选平板的霉菌培养斜面，接种针刮取霉菌孢子，接入无菌生理盐水中悬浮，并梯度稀释，制备霉菌孢子悬液；（4）待筛选霉菌菌悬液的接种：将步骤（3）中制备的待筛选霉菌孢子悬液涂布到步骤（1）中制备的定向筛选平板中，然后置于恒温恒湿培养箱中培养；（5）待筛选霉菌的生长速度和产葡萄糖酸能力的筛选：上述步骤（4）中的培养前期，观察定向筛选平板上单菌落周围培养基的变色情况。2.根据权利要求1所述的一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，其特征在于，步骤（1）中的制备的所有的筛选平板的主要步骤皆为配置PDA培养基。3.根据权利要求2所述的一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，其特征在于，配置PDA培养基所需原料包括：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。4.根据权利要求3所述的一种快速筛选生长迅速且高产葡萄糖酸的霉菌菌株的方法，其特征在于，步骤（1）中，PDA培养基的配置方法为：将去皮200g马铃薯切块、煮熟处理，再用纱布过滤，得到的滤液加入20g葡萄糖、15g琼脂粉和1000ml蒸馏水。5.根据权利要求4所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王松江，郭传庄，李俊霖，王建彬，隋松森，蔡超，李小双，孙瑞成，
申请(专利权)人：诸城东晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：