一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用制造技术

本发明专利技术属于环境微生物筛选技术领域，公开一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用。取采集的高砷沉积物样本在厌氧手套箱中加入含As

【技术实现步骤摘要】
一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用


[0001]本专利技术属于环境微生物筛选
，具体涉及一株耐砷发酵细菌的筛选及在修复砷污染环境下的发酵应用。

技术介绍

[0002]冶金和采矿等工业活动不断向自然环境中排放重金属砷，而砷因其高毒性和生物累积性使得砷污染防治修复问题日渐紧迫。自然环境中的砷及其化合物经过迁移转化最终富集到土壤、沉积物等厌氧环境中，而厌氧条件下厌氧发酵是最为重要的过程，为后续的硫酸盐还原、硫酸盐还原菌生物成矿过程提供氢气、电子供体、碳源等能源。
[0003]综上所述，耐砷发酵产氢气细菌的发现，在现有的微生物治理砷污染环境方面有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的为筛选出一株具有耐砷特性的发酵细菌，为砷污染环境修复提供应用。
[0005]为实现上述应用目的，本专利技术的技术方案：
[0006]一株耐砷发酵细菌(Clostridium butyricum)，该耐砷发酵细菌已于2023年1月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26434。
[0007]上述的耐砷发酵细菌的应用，所述耐砷发酵细菌具有200mg/L的As
3+
耐性，用于砷污染环境微生物修复。
[0008]上述的耐砷发酵细菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0009]第一步，取采集的高砷沉积物样品加入到五价砷发酵培养基中，并置于35℃摇床振荡避光培养；
[0010]第二步，将振荡培养后的耐砷发酵细菌液传代至五价砷发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养20h，重复该步骤三次，得到五价砷发酵培养基富集菌液；
[0011]第三步，将富集得到的菌液用质量体积比为0.1％的无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到半固体梭菌增殖培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；
[0012]第四步，挑取单菌落至液体发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养；
[0013]第五步，将第四步得到的菌液用质量体积比为0.1％无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到梭菌增殖半固体培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；
[0014]第六步，重复第四步、第五步三次，获得纯菌株。
[0015]进一步，第三步中，取菌液用无菌无氧质量体积比为0.1％无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释102‑
108倍，取105、106、107、108菌液涂布于平板直径9cm的梭菌增殖半固体培养上，涂布菌液体积为100μL，置于35℃厌氧生物培养箱中培养，培养时间24
‑
48h。
[0016]进一步，第四步中，挑取出的单菌落在厌氧箱中接种于盛装液体发酵培养基的西林瓶中，将接种后的密闭西林瓶置于35℃恒温振荡摇床，转速100r/min，培养时间24h。
[0017]进一步，第一步中，取0.14g高砷沉积物样品于无菌厌氧手套箱中，加入盛装无菌厌氧液体发酵培养基的西林瓶中，置于35℃摇床100r/min振荡避光培养。
[0018]进一步，第一步和第二步中，五价砷发酵培养基中的组分：葡萄糖10.0g、胰蛋白胨1.0g、酵母膏2.0g、氯化钠4.0g、氯化镁0.1g、L
‑
半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾1.5g、碳酸氢钠10.0g、刃天青0.5mg、砷酸钠166.5mg、超纯水1L、pH 6.80
‑
7.20。
[0019]进一步，第三步中，梭菌增殖半固体培养基中的组分：牛肉粉10.0g、胰蛋白胨10.0g、酵母粉3.0g、可溶淀粉1.0g、氯化钠5.0g、醋酸钠3.0g、L
‑
半胱氨酸0.5g、刃天青1.0mg、葡萄糖5.0g、琼脂8.0g、超纯水1L、pH 6.60
‑
7.00。
[0020]进一步，第四步中，液体发酵培养基中的组分：葡萄糖10.0g、胰蛋白胨1.0g、酵母膏2.0g、氯化钠4.0g、氯化镁0.1g、L
‑
半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾1.5g、碳酸氢钠10.0g、刃天青0.5mg、超纯水1L、pH 6.80
‑
7.20。
[0021]本专利技术的目的在于提供一种新的治理砷污染环境微生物修复方法，所述治理环境砷污染的方法使用所述耐砷细菌的筛选方法。
[0022]本专利技术的有益效果：本专利技术的优点为筛选方法成本低廉，为微生物修复砷污染环境提供耐砷发酵菌种资源。
附图说明
[0023]图1是本专利技术提供的耐砷发酵细菌的筛选方法与流程。
[0024]图2是本专利技术实施的耐砷发酵细菌三价砷胁迫下生长曲线。
[0025]图3是本专利技术实施的耐砷发酵细菌无机三价砷抑制浓度拟合情况。
[0026]图4是本专利技术实施的耐砷发酵细菌产丁酸情况。
[0027]图5是本专利技术实施的耐砷发酵细菌产乳酸情况。
[0028]图6是本专利技术实施的70mL体系下耐砷发酵细菌产氢气量。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的目的、实验方案更为清晰，对本专利技术进行进一步说明，针对现有微生物修复砷污染环境菌种资源不足问题，本专利技术提供了一种耐砷发酵细菌的筛选及应用。
[0030]本专利技术提供了一株耐砷发酵细菌，具体为耐砷发酵丁酸梭菌(Clostridium butyricum)在修复砷污染环境中的应用，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的保藏编号为CGMCC NO.26434。
[0031]本专利技术所述耐砷发酵丁酸梭菌其16s
·
rDNA优选序列如下所示：
[0032][0033][0034]实施例1
[0035]本专利技术所述耐砷丁酸梭菌分离筛选自葫芦岛市锦州湾地区，葫芦岛市锌厂排污口下游的高砷污染河口沉积物，对于所述筛选方法除非特殊说明，均为本领域技术人员公知方法。
[0036]如图1所示，本专利技术提供的耐砷发酵丁酸梭菌筛选方法包括以下步骤:
[0037]菌群活化：取0.2％质量体积比沉积物样品接种至五价砷浓度为60mg/L的无菌无
氧发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养；
[0038]富集培养：取活化好的菌液，依照1％体积比例加入到五价砷浓度为60mg/L的无菌无氧发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养，重复3次；
[0039]梯度稀释平板涂布：取富集后菌液，用0.1％质量体积比无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释102‑
108，取105‑
108涂布到RCM半固体培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；
[0040]菌株挑取、活化：挑取平板上单菌落至液体发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养；
[0041]重复平板涂布、菌种挑取活化三次，得到纯菌株；
[0042]总DNA提取；
[0043]16s
·
rDNA序列鉴定。
[0044]实施例2
[0045]结合实施例对本专利技术提供的耐砷发酵丁酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐砷发酵产氢气细菌，其特征在于，该耐砷发酵产氢气细菌已于2023年1月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.26434。2.权利要求1所述的耐砷发酵产氢气细菌的应用，其特征在于，所述耐砷发酵产氢气细菌具有200mg/L的As
3+
耐性，用于砷污染环境微生物修复。3.权利要求1所述的耐砷发酵产氢气细菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，取采集的高砷沉积物样品加入到五价砷发酵培养基中，并置于35℃摇床振荡避光培养；第二步，将振荡培养后的耐砷发酵细菌液传代至五价砷发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养20h，重复该步骤三次，得到五价砷发酵培养基富集菌液；第三步，将富集得到的菌液用0.1％质量体积比的无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到半固体梭菌增殖培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；第四步，挑取单菌落至液体发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养；第五步，将第四步得到的菌液用0.1％质量体积比无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到梭菌增殖半固体培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；第六步，重复第四步、第五步三次，获得纯菌株。4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，第三步取菌液用0.1％质量体积比无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释102‑
108倍，取105、106、107、108菌液涂布于平板直径9cm的梭菌增殖半固体培养基上，涂布菌液体积为100μL，置于35℃厌氧生物培养箱中培养，培...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾祥峰，高孟姗，刘纪委，李永斌，廉梅花，王少锋，贾永锋，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：