人原代急性髓系白血病细胞的培养基及培养方法技术

本发明专利技术提供了一种用于人原代急性髓系白血病细胞的培养基和培养方法。本发明专利技术的急性髓系白血病原代细胞培养基包含谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素

【技术实现步骤摘要】
人原代急性髓系白血病细胞的培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种原代细胞培养基，该培养基用于体外培养人原代急性髓系白血病(AML)细胞，并且涉及采用该培养基培养人原代急性髓系白血病细胞的方法，及其在药物的疗效评估和筛选中的应用。

技术介绍

[0002]急性髓系白血病(AML，Acute Myelocytic Leukemia)是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性血液疾病。AML是一种侵略性和高度异源性疾病，在生物学和预后上都有不同的亚型。AML每年每100,000人感染1至5个人，占所有新白血病病例的30％
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40％。AML是最致命的白血球疾病，其预后和生存率最差(5年时<26％)，自1970年代以来没有改善(Hanyang Lin等，Feeder
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free and serum
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free in vitro assay for measuring the effect of drugs on acute and chronic myeloid leukemia stem/progenitor cells，Experimental Hematology 2020；90:52
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64)。
[0003]迄今为止，AML干细胞是白血病研究的主要焦点，因为它们具有获得耐药性并介导复发的白血病亚克隆。这项工作通常需要培养AML干细胞。由于AML干细胞群体内的异质性，以及许多患者的细胞生长不良，易于分化并在体外丧失自我更新能力，因此培养AML干细胞具有挑战性。此外，原代AML患者样品可能难以获得，并且与转化的细胞系不同，它们不会无限期地体外扩增。体内异种移植模型允许扩增人AML细胞，但需要大量细胞(>106个细胞/小鼠)，并且不支持AML细胞维持。另一方面，与骨髓(BM)衍生的间充质基质细胞(MSCs)或基质细胞系共培养可以帮助保存AML干细胞，但饲养细胞的培养物不适用于高通量药物筛选或适应性试验。
[0004]因此，本领域需要一种无需与基质细胞共培养的、长时程、快速扩增的人原代急性髓系白血病细胞的培养基和培养方法。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于在体外快速扩增人原代急性髓系白血病细胞的培养基及培养方法。
[0006]本专利技术的一个方面在于提供一种人原代急性髓系白血病细胞的培养基，所述培养基包含谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素
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6(人IL
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6)、人白介素
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7(人IL
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7)、人白介素
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3(人IL
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3)、重组人FLT3Ligand(人FLT3L)、重组人巨噬细胞集落刺激因子(人M
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CSF)、和人干细胞因子(人SCF)。
[0007]在本专利技术的优选方面，所述人原代急性髓系白血病细胞的培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：
[0008](1)谷氨酰胺添加剂在培养基中的含量优选为0.5mM～4mM；
[0009](2)非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，非必需氨基酸在培养基中的含量优选为12.5μM～200μM；
[0010](3)人IL
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6在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～17ng/mL；
[0011](4)人IL
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7在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～51ng/mL；
[0012](5)人IL
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3在培养基中的含量优选为1.89ng/mL～153ng/mL；
[0013](6)人FLT3L在培养基中的含量优选为3ng/mL～81ng/mL；
[0014](7)人M
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CSF在培养基中的含量优选为1ng/mL～81ng/mL；
[0015](8)人SCF在培养基中的含量优选为1ng/mL～81ng/mL。
[0016]在另外优选的实施方式中，本专利技术的人原代急性髓系白血病细胞的培养基还包含基础培养基，所述基础培养基含有选自单核细胞无血清培养基和RPMI
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1640的初始培养基、5
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10％(v/v)的胎牛血清、以及选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。具体地，当选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25μg/mL～400μg/mL，优选为50μg/mL～200μg/mL，青霉素浓度范围为25U/mL～400U/mL，优选为50U/mL～200U/mL；当选自两性霉素B时，浓度范围为0.25μg/mL～4μg/mL，优选为0.5μg/mL～2μg/mL；当选自Primocin时，浓度范围为25μg/mL～400μg/mL，优选为50μg/mL～200μg/mL。
[0017]在另一方面，本专利技术还提供一种人原代急性髓系白血病细胞的体外培养方法，包括使用本专利技术的人原代急性髓系白血病细胞培养基对人原代急性髓系白血病细胞进行体外培养的步骤。
[0018]在优选的实施方式中，本专利技术的人原代急性髓系白血病细胞的体外培养方法包括以下步骤：
[0019]1.人原代急性髓系白血病细胞的分离和处理
[0020](1)对急性髓系白血病患者骨髓样本进行离心，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟；
[0021](2)离心后吸弃上层血浆，向血细胞沉淀中加入2～3倍量1x PBS稀释，充分混匀；加入6～8mL人外周血淋巴细胞分离液，加入上述稀释的血细胞沉淀，进行离心，离心转速为380～420g，升速1～2，降速0，温度20～28℃，离心时间为25～35分钟；
[0022](3)离心后，离心管中分层，吸取淋巴细胞层至3～6mL 1x PBS中，混匀洗涤细胞后离心，离心转速范围为1200～1600rpm，离心时间范围为2～6分钟；
[0023](4)弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞沉淀，裂解15～20分钟，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟；
[0024](5)离心后，弃上清，加入基础培养基备用。
[0025]2.使用本专利技术的人原代急性髓系白血病细胞培养基进行培养
[0026]将上述步骤1中获得的人原代急性髓系白血病细胞用本专利技术的人原代急性髓系白血病细胞培养基重悬并计数，按照细胞密度1
×
105～4
×
106个/cm2种入培养皿中，直至培养皿中细胞长满90％以上进行传代。
[0027]在又一个方面，通过本专利技术的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、急性髓系白血病细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及急性髓系白血病的新药研发等。因此，本专利技术还提供一种人原代急性髓系白血病细胞的药物筛选或疗效评估方法，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人原代急性髓系白血病细胞培养基，其特征在于，包含：谷氨酰胺添加剂、非必需氨基酸、人白介素
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6、人白介素
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7、人白介素
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3、重组人FLT3 Ligand、重组人巨噬细胞集落刺激因子、和人干细胞因子。2.如权利要求1所述的人原代急性髓系白血病细胞培养基，其特征在于，所述人原代急性髓系白血病细胞的培养基满足以下任意一项或多项或全部满足：(1)所述谷氨酰胺添加剂在培养基中的含量为0.5mM～4mM；(2)所述非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，所述非必需氨基酸在培养基中的含量为12.5μM～200μM；(3)所述人白介素
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6在培养基中的含量为1.89ng/mL～17ng/mL；(4)所述人白介素
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7在培养基中的含量为1.89ng/mL～51ng/mL；(5)所述人白介素
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3在培养基中的含量为1.89ng/mL～153ng/mL；(6)所述重组人FLT3 Ligand...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青松，赫玉影，陈程，黄涛，任涛，王文超，王黎，
申请(专利权)人：合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：