荧光探针及其应用制造技术

本申请公开了一种荧光探针，包括多肽、荧光供体以及荧光受体，荧光供体和荧光受体带有相反电荷，荧光供体和荧光受体分别连接于多肽的两端并被多肽隔开，多肽包括可被目标蛋白切割的肽段；当多肽被目标蛋白切割后，带相反电荷的荧光供体和荧光受体之间的距离减小，使得荧光供体和荧光受体之间荧光团振能量转移增加。本申请创造性地采用多肽底物作为荧光供体和荧光受体之间的“距离控制器”，结合荧光供体和荧光受体的静电吸附作用对两种粒子间距离进行控制，实现了通过荧光探针被目标蛋白切割前后产生的荧光信号变化，对目标蛋白的活性和/或浓度进行检测，拓宽基于肽的FRET分析系统的种类。统的种类。统的种类。

【技术实现步骤摘要】
荧光探针及其应用


[0001]本申请涉及荧光成像
，具体而言，涉及一种荧光探针及其应用。

技术介绍

[0002]荧光共振能量转移(FRET)是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体，Donor)的发射光谱与另一个基团(受体，Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。
[0003]简单地说，荧光共振能量转移就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的非辐射过程。具体地，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。
[0004]研究表明FRET系统中供体和受体之间距离的影响因素是复杂的，随着供体和受体间距离的增加，供体到受体的FRET显着减小，受体荧光强度减弱。传统FRET系统中，常以DNA为“分子尺”控制FRET系统供体和受体间距离。由于DNA结构相对灵活，DNA桥接的距离并不精确。因此，DNA介导的FRET系统调节存在准确度不高和细致度不够的问题。因此，如何提高FRET系统调节的准确度是拓宽FRET系统应用领域的难点。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本申请的第一目的在于提供一种荧光探针，包括多肽、荧光供体以及荧光受体，荧光供体和荧光受体带有相反电荷，荧光供体和荧光受体分别连接于多肽的两端并被多肽隔开，多肽包括可被目标蛋白切割的肽段；当所述多肽被目标蛋白切割后，带有相反电荷的荧光供体和荧光受体之间的距离减小，使得荧光供体和荧光受体之间荧光共振能量转移增加。
[0006]本申请创造性地采用功能多肽作为荧光探针中荧光供体和荧光受体之间的“距离控制器”，以对荧光供体和荧光受体之间的粒子间距离的控制，实现了通过功能多肽的切割过程产生的荧光信号变化对功能多肽的浓度进行检测，拓宽基于肽的FRET分析系统的种类；此外，肽具有比DNA更坚硬的结构，相比于DNA介导的FRET分析系统，本申请的荧光共振能量转移(FRET)荧光探针有利于实现更精确的距离控制，从而提高FRET分析系统的准确度。
[0007]其中一个实施例中，目标蛋白包括ATG4B蛋白、Caspase
‑
3蛋白以及MMP
‑
2蛋白中的至少一种。
[0008]其中一个实施例中，荧光探针中荧光供体为带负电的半导体聚合物点。
[0009]其中一个实施例中，荧光探针中荧光受体为带正电的有机荧光染料。
[0010]其中一个实施例中，荧光供体连接于多肽的C端，荧光受体连接于多肽的N端。
[0011]其中一个实施例中，多肽包括调节肽段，调节肽段的两端分别连接荧光供体和可被目标蛋白切割的肽段。
[0012]其中一个实施例中，荧光探针的平均直径为5nm～30nm。
[0013]其中一个实施例中，荧光探针中的多肽被目标蛋白切割后，荧光供体和荧光受体之间的距离小于10nm。
[0014]其中一个实施例中，半导体聚合物点选自PFBT聚合物点、PFPV聚合物点、PDHF聚合物点、PPE聚合物点、MEH
‑
PPV聚合物点以及PFO聚合物点中的至少一种。
[0015]其中一个实施例中，有机荧光染料选自罗丹明染料和花青染料中的至少一种。
[0016]其中一个实施例中，罗丹明染料包括罗丹明B。
[0017]其中一个实施例中，花青染料包括Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5中的至少一种。
[0018]其中一个实施例中，荧光供体通过链霉亲和素
‑
生物素亲和偶联多肽。
[0019]其中一个实施例中，调节肽段为多聚脯氨酸。
[0020]其中一个实施例中，多聚脯氨酸的聚合度为5～50。
[0021]其中一个实施例中，多肽的序列满足以下特征的至少一个：
[0022](1)多肽中可被ATG4B蛋白切割的肽段的序列包括GSFGFT；
[0023](2)所述多肽中可被Caspase
‑
3蛋白切割的肽段的序列包括DVEDGCC；
[0024](3)所述多肽中可被MMP
‑
2蛋白切割的肽段的序列包括GRVGLPG；
[0025](3)多肽C端的序列包括K，所述多肽N端的序列包括R。
[0026]本申请的第二目的在于提供一种上述荧光探针在制备目标蛋白检测试剂中的应用。
[0027]本申请的第三目的在于提供一种检测目标蛋白的方法，包括：将含有目标蛋白的生物样品和上述荧光探针混合反应，使目标蛋白切割荧光探针的多肽；
[0028]检测反应结束后荧光探针被生物样品中的目标蛋白切割产生的荧光信号。
[0029]其中一个实施例中，目标蛋白包括ATG4B蛋白、Caspase
‑
3蛋白以及MMP
‑
2蛋白中的至少一种。
[0030]其中一个实施例中，生物样品中含有的ATG4B蛋白的浓度为0～20μg/mL。
[0031]其中一个实施例中，生物样品包括全血、血清、血浆、滑液、细胞或组织中的至少一种。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]图1为本申请实施例1中基于PFBT Pdot与RhoB之间的FRET原理构建多肽荧光探针用于细胞自噬关键分子ATG4B的荧光定量分析示意图；
[0034]图2为本申请实施例1中制备PFPV Pdot使用的原料PFPV的结构式；
[0035]图3为本申请实施例1中PFBT Pdot的形态、光学和电学特性表征示意图；在图3中，a表示PFBT Pdot流体力学直径分析图及TEM图；b表示PFBT Pdot荧光光谱和RhoB紫外可见吸收光谱图，激发光波长460nm；c表示10ppm PFBT Pdot溶液中加入不同浓度RhoB后荧光光谱图，激发光波长460nm；d表示PFBT Pdot偶联SA和三种长度刚性多肽后的表面电势；
[0036]图4为本申请实施例2中PFBT Pdot偶联多肽对ATG4B响应的实验结果图；在图4中，a表示PFBT Pdot偶联peptide1所构建荧光探针的荧光光谱图，b表示PFBT Pdot偶联peptide2所构建荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.荧光探针，其特征在于，包括多肽、荧光供体以及荧光受体，所述荧光供体和所述荧光受体带有相反电荷，所述荧光供体和所述荧光受体分别连接于所述多肽的两端并被所述多肽隔开，所述多肽包括可被目标蛋白切割的肽段；当所述多肽被目标蛋白切割后，带有相反电荷的所述荧光供体和所述荧光受体之间的距离减小，使得所述荧光供体和所述荧光受体之间荧光共振能量转移增加。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针满足以下特征中的至少一个：(1)所述目标蛋白包括ATG4B蛋白、Caspase
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3蛋白以及MMP
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2蛋白中的至少一种；(2)所述荧光探针中荧光供体为带负电的半导体聚合物点；(3)所述荧光探针中荧光受体为带正电的有机荧光染料；(4)所述荧光探针中荧光供体连接于所述多肽的C端，荧光受体连接于所述多肽的N端；(5)所述多肽包括调节肽段，所述调节肽段的两端分别连接所述荧光供体和所述可被目标蛋白切割的肽段；(6)所述荧光探针的平均直径为5nm～50nm；(7)所述荧光探针中的多肽被目标蛋白切割后，所述荧光供体和所述荧光受体之间的距离小于10nm。3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述半导体聚合物点选自PFBT聚合物点、PFPV聚合物点、PDHF聚合物点、PPE聚合物点、MEH
‑
PPV聚合物点以及PFO聚合物点中的至少一种；和/或所述有机荧光染料选自罗丹明染料和花青染料中的至少一种；优选的，罗丹明染料包括罗丹明B染料；优选的，花青染料包括Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5中的至少一种。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴长锋，李媛，房晓峰，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：