多肽切割方法技术

提供了用于在多肽内的一个或多个特定位置处切割多肽的方法和构建体。置处切割多肽的方法和构建体。置处切割多肽的方法和构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】40和41，以及氨基酸序列SEQ ID NO：9；(j)多核苷酸序列SEQ ID NO 43和44，以及氨基酸序列SEQ ID NO：11；(k)多核苷酸序列SEQ ID NO 45和46，以及氨基酸序列SEQ ID NO：12；(1)多核苷酸序列SEQ ID NO 48和49，以及氨基酸序列SEQ IDNO：14；(m)多核苷酸序列SEQ ID NO 50和51，以及氨基酸序列SEQ ID NO：15；(n)多核苷酸序列SEQ ID NO 53和54，以及氨基酸序列SEQ ID NO：17；(o)多核苷酸序列SEQ ID NO 56和57，以及氨基酸序列SEQ ID NO：19；(p)多核苷酸序列SEQ ID NO 59和60，以及氨基酸序列SEQ ID NO：21；以及(q)多核苷酸序列SEQ ID NO 26、27、61
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66和79
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119中的任何两个或更多个，以及氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一些实例中，表达构建体是表达载体。在另外的实例中，表达构建体是双启动子表达载体，例如包含L
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阿拉伯糖诱导型启动子和丙酸盐诱导型启动子的双启动子表达载体。
[0013]还提供了用于产生靶多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包括产生组合物，所述组合物包含本文所提供的内含肽融合多肽，其中内含肽氨基酸序列从所述内含肽融合多肽自切除，由此产生靶多肽；并从所述组合物回收靶多肽。在一些实施例中，产生所述组合物包括在宿主细胞中表达内含肽融合多肽。所述方法还可包括裂解宿主细胞。在一些实例中，裂解宿主细胞产生所述组合物。在一些实施例中，所述宿主细胞具有功能水平降低的硫氧还蛋白还原酶以及功能水平降低的选自由谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽合成酶组成的组的蛋白质。例如，所述宿主细胞具有改变的形式的编码AhpC的基因，所述基因选自由以下组成的组：ahpC*、ahpCΔ、V164G、S71F、E173/S71F、E171Ter和dup162
‑
169突变，和/或所述宿主细胞包含编码DsbC的细胞质形式的多核苷酸。在一些实施例中，所述宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(例如大肠杆菌B品系521细胞)。
[0014]还提供了包含所公开的表达构建体的宿主细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞具有功能水平降低的硫氧还蛋白还原酶以及功能水平降低的选自由谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽合成酶组成的组的蛋白质。在一些实例中，所述宿主细胞具有改变的形式的编码AhpC的基因，所述基因选自由以下组成的组：ahpC*、ahpCΔ、V164G、S71F、E173/S71F、E171Ter和dud162
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169突变，和/或所述宿主细胞包含编码DsbC的细胞质形式的多核苷酸。在一些实施例中，所述宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌细胞(例如大肠杆菌B品系521细胞)。
附图说明
[0015]图1A和1B显示在大肠杆菌宿主细胞中表达的内含肽
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TRAST
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Fab构建体的蛋白质印迹。TRAST
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Fab重链和轻链被表达成在所述重链和轻链的N末端处各自连接有各种内含肽多肽序列；所有的内含肽都不含N末端半胱氨酸残基以防止外显肽连接。所用内含肽的类型示于每个印迹的上方。DnaX：集胞藻(Synechocystis)DnaX 6
×
His标记的微型内含肽(mini
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intein)；DnaB：集胞藻DnaB 6
×
His标记的微型内含肽；D.t.DnaB：嗜热地下脱硫腊肠状菌(Desulfofundulus thermosuberraneus)DSM 16057DnaB内含肽；gp41
‑
1：原绿球藻噬蓝藻体(Prochlorococcus cyanophage)P
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SSM2 gp41
‑
16
×
His标记的微型内含肽；以及N.p.DnaB：点形念珠藻(Nostoc punctiforme)品系ATCC29133/PCC 73102DnaB微型内含肽。
‘
P
’
指示通过离心而沉淀的材料，而
‘
S
’
指示保持可溶性的材料。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，在非还原条件下(图1A)和在还原条件下(图1B)分离对应于各孔的TRAST
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Fab蛋白质样本。由这些凝胶制造的蛋白质印迹利用了结合至人IgG的一级抗体。MW(kDa)：分子量(质量)标
记物。未被切割的蛋白质和被切割蛋白质的谱带的位置用箭头和符号指示：图A(非还原)，从顶部起：具有未被切割的内含肽的Fab异二聚体、具有从两种多肽切割的内含肽的Fab异二聚体、被切割的单体Fab多肽；图B(还原)，从顶部起：具有未被切割的内含肽的单体Fab多肽、被切割的单体Fab多肽。
[0016]图2A
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2C是一系列色谱图，显示了利用液相色谱质谱法(LC
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MS)分析的切割了内含肽(但其它方面完整)的内含肽
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TRAST
‑
Fab多肽的结构与对照Met
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TRAST
‑
Fab的结构的比较。如图1所描述，表达的DnaB
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TRAST
‑
Fab和gp41
‑1‑
TRAST
‑
Fab蛋白质具有N末端内含肽序列。将蛋白质样本通过亲和色谱法，利用蛋白质L纯化，接着用TCEP(三(2
‑
羧基乙基)膦)还原并用甲酸酸化。图A显示了针对洗脱时间标绘的任意强度单位的吸光度，并且图B和C是针对洗脱时间标绘，以计数/秒(CPS)为单位；图B和C的图例中的单位道尔顿(
‘
Da
’
)是指质量/电荷(m/z)。图2A：在214nm处UV光的吸光度，显示了来自第13分钟至第18分钟的洗脱液，该洗脱液包括轻链和重链两者的洗脱液。DnaB
‑
TRAST
‑
Fab在与Met
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TRAST
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Fab对照相当的位置处展现峰。图2B：在具有天然N末端的TRAST
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Fab轻链的预测质量/电荷范围内的蛋白质的提取离子流色谱图峰。当在与产生明显量的天然N末端轻链的DnaB
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TRAST
‑
Fab和gp41
‑1‑
TRAST
‑
Fab样本相同的强度标度上观察时，Met
‑
TRAST
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Fab对照样本不包括可检测的天然N末端轻链。图2C：在具有天然N末端的TRAST
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Fab重链的预测质量/电荷范围内的蛋白质的提取离子流色谱图峰。本图中所示的TRAST
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Fab重链的结果与图B中所示的轻链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】ID NO：123的氨基酸100
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129以及SEQ ID NO：124的氨基酸100
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129。5.根据权利要求4所述的内含肽多肽，包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸105
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124、SEQ ID NO：1的氨基酸93
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112、SEQ ID NO：4的氨基酸85
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104、SEQ ID NO：12的氨基酸1
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21、SEQ ID NO：15的氨基酸1
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21、SEQ ID NO：120的氨基酸105
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124、SEQ ID NO：121的氨基酸105
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124、SEQ ID NO：122的氨基酸105
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124、SEQ ID NO：123的氨基酸105
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124以及SEQ ID NO：124的氨基酸105
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124；或包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1的氨基酸88
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117、SEQ ID NO：2的氨基酸100
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129、SEQ ID NO：4的氨基酸80
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109、SEQ ID NO：12的氨基酸1
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30、SEQ ID NO：15的氨基酸1
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30、SEQ ID NO：120的氨基酸100
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129、SEQ ID NO：121的氨基酸100
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129、SEQ ID NO：122的氨基酸100
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129、SEQ ID NO：123的氨基酸100
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129以及SEQ ID NO：124的氨基酸100
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129。6.根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽，其中所述内含肽氨基酸序列不含N末端半胱氨酸残基。7.根据权利要求1至6中任一项所述的内含肽多肽，其中所述内含肽多肽缺乏显著的外显肽连接活性。8.根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽，其中所述内含肽多肽包含多组氨酸标签。9.根据权利要求8所述的内含肽多肽，其中所述多组氨酸标签包含6
×
His标签。10.根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽，其中所述内含肽多肽包含能被蛋白酶切割的切割序列。11.根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽，包含SEQ ID NO：1、2、4、12、15和120
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124中的任一个的氨基酸序列。12.一种内含肽融合多肽，包含根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽的氨基酸序列和靶多肽的氨基酸序列。13.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述靶多肽的氨基酸序列的N末端氨基酸是靶蛋白的成熟形式的氨基酸序列的N末端氨基酸。14.根据权利要求13所述的内含肽融合多肽，其中所述靶多肽可形成一个或多个二硫键。15.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述靶多肽包含选自由以下组成的组的多肽：抗体重链、抗体轻链及其片段。16.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述内含肽融合多肽不含信号序列。17.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述内含肽氨基酸序列不含N末端半胱氨酸残基。18.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述内含肽融合多肽缺乏显著的外显肽连接活性。19.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述内含肽融合多肽包含多组氨酸标签。20.根据权利要求19所述的内含肽融合多肽，其中所述多组氨酸标签包含6
×
His标签。21.根据权利要求12所述的内含肽融合多肽，其中所述内含肽融合多肽包含能被蛋白酶切割的切割序列。
22.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至5中任一项所述的内含肽多肽。23.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码内含肽多肽并且包含选自由SEQ ID NO 24
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119组成的组的核苷酸序列。24.一种表达构建体，包含两个或更多个编码内含肽的多核苷酸序列，其中各编码内含肽的多核苷酸序列不同于每一其它的编码内含肽的多核苷酸序列，并且其中由所述编码内含肽的多核苷酸序列所编码的每个内含肽多肽具有相同的氨基酸序列，或其中由所述编码内含肽的多核苷酸序列所编码的内含肽多肽中的至少两个具有不同的氨基酸序列。25.根据权利要求24所述的表达构建体，其中所述两个或更多个编码内含肽的多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：24
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119组成的组。26.根据权利要求24所述的表达构建体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：ABSCI公司，
类型：发明
国别省市：