一种耐高温BstDNA聚合酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明专利技术通过对天然Bst DNA聚合酶基因进行了随机突变，并进行高热稳定性的筛选，最终成功筛选得到一种耐高温Bst DNA聚合酶Bst

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种耐高温Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年随着非洲猪瘟疫情的发展，核酸检测技术已变得非常普及。而且核酸检测还被广泛应用于其他多种病原检测、遗传疾病诊断、法医鉴定以及食品致病菌的筛查。核酸检测技术基于应用场景主要分为两个方向，一种是偏重于实验室确诊检测的PCR技术，一种是适用于现场快速检测的等温扩增技术。PCR技术敏感、准确，因此被广泛用于医院、疫控和第三方检测机构的核酸检测。但由于PCR所需仪器设备昂贵，难以便携，而且对于检测人员和检测环境要求较高，使其不适用于现场快速检测、临床床边检测以及硬件条件欠佳环境的检测。目前对于核酸即时检测(POCT)的需求越来越大，流行疫病筛查、环境病原监测、食品致病菌鉴定等领域都需要实现现场、快速、高灵敏的核酸检测技术。等温扩增技术由于不需要大型仪器设备和专业实验室，而且检测时间仅为PCR技术的1/3
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1/5，已被广泛应用于核酸POCT领域。
[0003]等温扩增技术根据核酸扩增原理不同，包括：基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence
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based amplification，NASBA)、链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)、环介导等温扩增(loop
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mediated amplification，LAMP)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、信号介导的RNA技术扩增(signal mediated amplification of RNA technology，SMART)、解旋酶
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依赖性扩增(helicase
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dependent amplification，HDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、切口核酸内切酶信号扩增(nicking endonuclease signal amplification，NESA)和切口核酸内切酶辅助纳米粒子激活(nicking endonuclease assisted nanoparticle activation，NENNA)。尽管多个等温扩增技术被证明可用于核酸检测，但应用最广泛的依然是LAMP和RPA技术，而LAMP技术由于低廉的成本和高效的扩增效率，占据了核酸POCT超90％的市场。
[0004]尽管LAMP技术已被广泛应用于核酸POCT领域，但该技术依然存在一定的技术短板。核酸检测包括样本处理和核酸扩增两个关键环节，而核酸POCT由于环境条件限制，无法利用核酸提取仪进行样本核酸的提取，所以一般采用加热裂解病毒或细菌，使其核酸释放出来，进一步作为模板进行核酸扩增检测。这种两步法操作具有2个缺陷：1、由于开展POCT的环境不具备负压条件，热裂解后打开管盖转移模板的过程，释放的核酸分子容易形成气溶胶，从而造成核酸检测的假阳性结果；2、两步操作增大了工作量和污染的风险。因此，若能实现将热裂解与核酸扩增在一个反应管中不开盖完成，则能完美解决以上两个问题。然而，目前LAMP反应所需的Bst酶最适反应温度是60
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65度，超过70度会迅速失活，使得该目标无法达成。因此，若能大幅提升Bst酶的热稳定性，将能够实现本目标。
[0005]Bst酶是来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(以前称为嗜热脂肪芽孢杆菌)的耐热DNA聚合
酶，它是负责DNA复制和修复的细胞机制的重要组成部分。根据氨基酸序列比较和蛋白晶体结构分析将DNA聚合酶超家族划分为A、B、C、D、X、Y和RT七个家族。Bst酶属于DNA聚合酶A家族，它同时具备5
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核酸外切酶活性、DNA聚合酶活性和链置换活性。由于外切酶活性会影响DNA聚合酶的效力，因此用于LAMP反应的Bst都是去除了其N端约300个氨基酸外切酶区域的Bst截短大片段，从而只保留了DNA聚合酶活性。为了提升LAMP反应的扩增效率，多个研究机构尝试对Bst酶进行改造。尽管对于Bst DNA聚合酶的改造取得了不错的成绩，然而目前依然没有研究实现大幅提升Bst DNA聚合酶的耐热性能，当前基于LAMP技术的核酸POCT领域依然对于更高耐受温度的Bst DNA聚合酶存在需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种耐高温的Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为将Bst DNA聚合酶氨基酸序列的第13位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第94位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，且将第118位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第158位的丙氨酸突变为脯氨酸，且将第283位的甘氨酸突变为天冬氨酸，且将第446位的脯氨酸突变为丝氨酸，且将第461位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，且保持所述Bst DNA聚合酶其它氨基酸序列不变后得到的蛋白质。所述Bst DNA聚合酶氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0008]上述蛋白质可为如下(a1)
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(a3)中任一所述的蛋白质：
[0009](a1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010](a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过除第13位、第94位、第118位、第158位、第283位、第446位和第461位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
[0011](a3)将(a1)或(a2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0012]上述(a2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0013]上述(a3)中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
[0014]上述(a2)或(a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015]上述任一所述蛋白质中，所述蛋白质的热稳定性高于所述Bst DNA聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，所述蛋白质为将Bst DNA聚合酶氨基酸序列的第13位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第94位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，且将第118位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，且将第158位的丙氨酸突变为脯氨酸，且将第283位的甘氨酸突变为天冬氨酸，且将第446位的脯氨酸突变为丝氨酸，且将第461位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，且保持所述Bst DNA聚合酶其它氨基酸序列不变后得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(a1)
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(a3)中任一所述的蛋白质：(a1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过除第13位、第94位、第118位、第158位、第283位、第446位和第461位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；(a3)将(a1)或(a2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)
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(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子；(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子。5.下述(c1)
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(c3)中任一所述的生物材料：...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利敏，
申请(专利权)人：北京诺派生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：