一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法技术

本发明专利技术提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，属于农业技术领域。本发明专利技术提供的方法包括以下步骤：提供人参黑斑菌的发酵液；采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；以二氯甲烷

【技术实现步骤摘要】
一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法


[0001]本专利技术涉及农业
，尤其涉及一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法。

技术介绍

[0002]人参(Panaxginseng)作为一种名贵中药，具有提高人体免疫力、提供营养、改善疲劳和增强抵抗力的作用。人参在其生产过程中易遭受病原菌的侵染，如无人工干预，其最终存苗率通常低于25％。迄今已报道的人参重要病害多达10余种，其中人参黑斑病是一种由寄主特异性病菌链格孢属人参黑斑菌(Alternariapanax)引发的病害，该病害每年发病率在20～30％甚至更高，造成约10～20％的产量损失。每年5月下旬至6月上旬，环境温度高于11℃时，人参植株地上残留部分休眠的分生孢子开始萌发，并引起土壤中人参幼茎黑斑病的发生，使之成为主要传染源。随后，分生孢子围绕坏死的茎开始发育，成为新的侵染源，导致相邻植株上的茎叶相继出现严重的黑斑。人参幼苗被人参黑斑菌侵染后，其茎将逐渐被病菌环形侵染，出现倒伏，最后枯萎腐败。对于成熟人参植株，其叶面通常在夏季被侵染，侵染过程中叶面出现迅速扩大的深褐色坏死斑，叶片周围会逐渐褪绿。
[0003]综上，人参黑斑菌侵染会使人参植株地上部分产生明显枯斑，但枯斑的产生机制尚不清楚。目前有研究显示，从人参黑斑菌的代谢产物中分离得到了邻苯二甲酸丁酯，但后期实验验证了所述邻苯二甲酸丁酯不具备成为人参黑斑病致病物质的毒素条件。需要进一步探究人参黑斑病菌毒素种类，对阐明枯斑产生原因以及人参黑斑菌防治工作具有重要意义。

技术实现思路
<br/>[0004]本专利技术的目的在于提供一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，本专利技术通过对人参黑斑菌的代谢产物进行分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，其对人参叶片具有植物毒活性，为人参黑斑菌毒素。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：
[0007]提供人参黑斑菌的发酵液；
[0008]采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；
[0009]以二氯甲烷
‑
甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr
‑
A、Fr
‑
B、Fr
‑
C、Fr
‑
D、Fr
‑
E、Fr
‑
F；
[0010]将所述组分Fr
‑
B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。
[0011]优选地，所述萃取前还包括：将所述发酵液进行过滤，收集滤液作为待萃取液。
[0012]优选地，所述萃取剂为乙酸乙酯。
[0013]优选地，进行所述硅胶柱层析分离时所用拌样硅胶的目数为60～100目，分离硅胶的目数为200～300目。
[0014]优选地，进行所述硅胶柱层析分离时，所述总提物浸膏与拌样硅胶的质量比为1：(1.2～1.5)，所述总提物浸膏与分离硅胶的质量比为1:(12～15)。
[0015]优选地，按二氯甲烷与甲醇的体积比计，所述洗脱剂的组成依次为1:0、100:1、80:1、50:1、30:1、5:1。
[0016]优选地，进行所述硅胶柱层析分离时，每个梯度所用洗脱剂的体积为2～5个柱体积。
[0017]优选地，进行所述葡萄糖凝胶色谱柱分离所用洗脱剂为甲醇。
[0018]优选地，所述高效液相色谱纯化的条件包括：以甲醇和水为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为0～35min，甲醇由20％增加至100％，流速为2mL/min；色谱柱为反相硅胶半制备柱，型号为YMC
‑
packODS
‑
A，规格为250
×
10mm，5μm；收集t
R
为18.0min的色谱峰对应的纯化液。
[0019]优选地，所述高效液相色谱纯化后还包括：去除所述纯化液中溶剂，得到对羟基苯乙醇。
[0020]本专利技术提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：提供人参黑斑菌的发酵液；采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；以二氯甲烷
‑
甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr
‑
A、Fr
‑
B、Fr
‑
C、Fr
‑
D、Fr
‑
E、Fr
‑
F；将所述组分Fr
‑
B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。本专利技术通过对人参黑斑菌的代谢产物进行分离，最终得到了单体化合物对羟基苯乙醇，并通过叶片穿刺渗透实验验证了其对人参叶片具有植物毒活性，说明所述对羟基苯乙醇为人参黑斑菌毒素，对探究人参黑斑菌导致的枯斑的产生原因及人参黑斑菌防治工作具有重要意义。
附图说明
[0021]图1为测试例1中植物毒活性测试结果图。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：
[0023]提供人参黑斑菌的发酵液；
[0024]采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；
[0025]以二氯甲烷
‑
甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr
‑
A、Fr
‑
B、Fr
‑
C、Fr
‑
D、Fr
‑
E、Fr
‑
F；
[0026]将所述组分Fr
‑
B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。
[0027]本专利技术从人参黑斑菌的代谢产物中分离出对羟基苯乙醇，其能对寄主人参表现出植物毒活性，为人参黑斑菌毒素；所述对羟基苯乙醇易溶于甲醇，可溶于丙酮、乙腈，紫外吸
收波长通常在210～280nm之间；所述对羟基苯乙醇具有式I所示结构：
[0028][0029]本专利技术提供人参黑斑菌的发酵液。本专利技术对所述人参黑斑菌(Alternaria panax)的来源没有特殊限定，本领域技术人员熟知来源的人参黑斑菌均可。本专利技术优选将人参黑斑菌株于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上进行扩增，然后将处于对数期的人参黑斑菌接种到马铃薯葡萄糖水(PDW)培养基上进行发酵，得到人参黑斑菌的发酵液。在本专利技术中，所述PDA培养基的配方优选为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，其余本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从人参黑斑菌的代谢产物中分离真菌毒素的方法，所述真菌毒素为对羟基苯乙醇，包括以下步骤：提供人参黑斑菌的发酵液；采用萃取剂对所述发酵液进行萃取，去除所得萃取液中溶剂，得到总提物浸膏；以二氯甲烷
‑
甲醇为洗脱剂，在梯度洗脱条件下将所述总提物浸膏进行硅胶柱层析分离，共得到6个亚组分，依次记为组分Fr
‑
A、Fr
‑
B、Fr
‑
C、Fr
‑
D、Fr
‑
E、Fr
‑
F；将所述组分Fr
‑
B依次进行葡萄糖凝胶色谱柱分离和高效液相色谱纯化，得到对羟基苯乙醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取前还包括：将所述发酵液进行过滤，收集滤液作为待萃取液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述萃取剂为乙酸乙酯。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述硅胶柱层析分离时所用拌样硅胶的目数为60～100目，分离硅胶的目数为200～300目。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行所述硅胶柱层析分...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁刚，李勇，陈卉青，王蓉，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：