用于质谱分析的预分离制造技术

本发明专利技术涉及一种分离多种与基质结合的分析物的方法，所述方法包括：(a)用多种洗脱液洗脱所述分析物，其中第一洗脱步骤采用包含第一编号洗脱液的洗脱缓冲液，随后第n次洗脱步骤用包含第n编号洗脱液的洗脱缓冲液，其中所述第(n)编号洗脱液比第一编号洗脱液具有更低的偶极矩和/或更高的疏水性。偶极矩和/或更高的疏水性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于质谱分析的预分离


[0001]本专利技术涉及一种分离多种与基质结合分析物的方法，所述方法包括：(a)用多种洗脱液洗脱所述分析物，其中第一洗脱步骤采用包含第一编号洗脱液的洗脱缓冲液，随后第n次洗脱步骤用包含第n编号洗脱液的洗脱缓冲液，其中所述第(n)编号洗脱液比第一编号洗脱液具有更低的偶极矩和/或更高的疏水性。
[0002]本说明书引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文件公开内容与本专利技术专利无关，但其全部内容在此引入作为参考。更具体地说，所有参考文献的引入相当于具体、单独地引入每个文献。

技术介绍

[0003]液相色谱
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电喷雾质谱(LC
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ESI
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MS)是一种对复杂分析物的混合物进行定性和定量分析的既定方法。待分析物通常具有较大的动态范围(分析物的最大和最小丰度)，其中液相色谱用于在空间和时间上分离这些分析物，以便于在质谱端完成测量。液相色谱的一维分离对于某些分析物样品来说可能是足够的，但是高度复杂的生物样品通常导致质谱仪的大部分容量仅被大量丰富的分析物吸收。由于所述高丰度分析物的存在，既定方法往往不能检测同样在检测极限内但却逃避了检测的低丰度分析物。

技术实现思路

[0004]鉴于这些缺陷，本专利技术的技术问题是提供改进的分析装置和方法，尤其是在质谱仪中。该技术问题的解决见所附权利要求书。
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种分离多种与基质结合分析物的方法，所述方法包括：(a)用多种洗脱液洗脱所述分析物，其中第一洗脱步骤使用包含第一种洗脱液的洗脱缓冲液，随后的第n次洗脱步骤使用包含第n种洗脱液的洗脱缓冲液，其中所述第n种洗脱液比所述第一种洗脱液具有更低的偶极矩和/或更高的疏水性。
[0006]与此相关的是，本专利技术提供了一种分离多种与基质结合分析物的方法，所述方法包括：(a)用多种洗脱液洗脱所述分析物，其中第一洗脱步骤使用包含第一种洗脱液的组合物，随后第n次洗脱步骤使用包含第n种洗脱液的组合物，其中至少一种第n种洗脱液与所述第一种洗脱液相比具有不同的偶极矩和/或疏水性；其中所述分析物是或包含肽、蛋白质和/或多肽；并且其中优选地，至少一种所述洗脱液选自吡啶、哌啶、三乙胺、吡咯、取代吡啶和取代吡咯。
[0007]所述组合物在本文中也称为“洗脱组合物”。
[0008]术语“分离”有其既定含义。在最一般的形式中，分离是指在一定程度上分离混合物中存在的分析物。如果可能的话，该术语包括某些分析物的选择性富集。在理想情况下，每次分离将完全分离分析物，没有任何重叠(假设完全分离和/或极小分离)。虽然通常不可能，但是分离被认为是改善下游分析方法结果的一种手段。所述“下游分析方法”一词可以指单一分析方法，也可以指多于一种的一系列分析方法。
[0009]仅举一个例子，第一方面的分离方法之后可以是液相色谱(LC)。使用分析术语，第一方面的方法提供了第一维分离，以及第二维液相色谱分离。液相色谱之后可能是质谱(MS)，LC和MS的结合构成“下游分析方法”。第一方面的方法在本文中也称为“预分离”。通常，预分离与上述下游分析方法在物理上是分开的。为此，第一方面的预分离也被称为“离线”。另一方面，许多实现中LC和MS是物理耦合的，也称为“在线”。
[0010]重要的是，本专利技术的预分离不受应用单一洗脱液的影响。相反，它涉及至少两种，可能的话有三种或更多种不同的洗脱液。值得注意的是，根据本专利技术使用时，多种洗脱液没有梯度，其中在洗脱过程中，随时间推进，第一种洗脱液的浓度会增加，而第二种洗脱液的浓度会降低。
[0011]本领域既定梯度也可以以逐步方式实现(两种洗脱液相对量不连续变化)，但应该注意，本专利技术的方法虽然是逐步的，但与已有的不同：第n次洗脱液是不同于第一次洗脱液的化合物，并且如果可能的话，含有第n次洗脱液的洗脱组合物不包含第一次洗脱液，反之亦然。
[0012]所述“分析物”一词是指样品中存在的分子种类。样品通常包含各种不同的分析物，如由数千个不同蛋白质或肽组成的人类蛋白质组，这些不同的蛋白质或肽数量各不相同，可以是肽的单个复制，也可以是数百万个复制。因此，分析物的数量没有特别限制。在基于LC
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MS自下而上蛋白质组学分析的情况下，必须理解蛋白质通常在分析前被蛋白水解消化。由此产生上述的肽。
[0013]术语“基质”一词是指区别吸收分析物的材料。基质可以体现为众所周知的树脂、珠粒和浆料等。基质可以体现为预填充的柱，而在本专利技术中，基质是优选的小柱形式。更具体地说，小柱是指固相萃取(SPE)小柱，通常是预先填充有基质的消耗品。固相萃取小柱通常具有操作简单的优势，且无需特殊设备。固相萃取小柱可以各种形式使用，包括但不限于旋转柱、正压、负压或甚至连接到流动泵上。小柱可以在低通过量或高通过量应用(如96倍并行)中复用。
[0014]由于混合物中的分析物通常在疏水性、电荷状态和大小等一种或多种性质方面彼此不同，大多数基质材料(除了假设的完全惰性基质材料)与分析物存在不同程度的结合。优选的基质材料将在下面进一步描述。
[0015]第一方面的方法开始于已经进行过基质装载和任意清洗的地方。因此，第一方面的方法主要是洗脱。既定洗脱方案可能涉及苛刻的条件，如需要分解几乎所有的分析物。或者，可以采用相同洗脱液不同量的梯度。梯度实现了洗脱条件的连续或逐步变化，通常可以实现分析物的分离。
[0016]根据本专利技术，洗脱是逐步进行的。然而，与既有梯度等方法不同的是，不同洗脱缓冲液中使用的化学品在相同洗脱液成分的相对量方面彼此没有区别；这不是本专利技术的关键概念。决定性的区别在于，在本专利技术中，每种洗脱缓冲液包含特用于该洗脱组合物或洗脱缓冲液的独特化学洗脱液。该洗脱液称为“编号洗脱液”，用于清楚表明其用途是特用于特定洗脱步骤(并且也可选择性地用于特定洗脱组合物或洗脱缓冲液)。
[0017]这种方法具有明显优点，从示例数据中可以明显看出。为了进一步解释并考虑作为优选示例的复杂肽混合物样品，通过蛋白质组蛋白水解消化获得的单个肽在净表面电荷和/或疏水性方面彼此不同。根据第一方面的要求，使用在疏水性和/或偶极矩方面彼此不
同的多种编号洗脱液，第一方面的方法直接解决了分析物的不同净表面电荷和/或不同疏水性。洗脱组合物或洗脱缓冲液优选包含或就是溶剂，可能的话，最后包含或就是有机溶剂。
[0018]因此，给定洗脱组合物或洗脱缓冲液的关键成分是给定编号的洗脱液。尽管如此，洗脱组合物或洗脱缓冲液可包含下文进一步公开的其他成分。
[0019]偶极矩和疏水性都可以使用本领域中的参数来表示。这里的术语“偶极矩”一词是指电偶极矩。电偶极矩是系统(本文中为分子)中正负电荷分离的度量。根据本专利技术，相关的分子是分析物，特别是肽，以及洗脱组合物或洗脱缓冲液的成分，特别是上述编号洗脱液。电偶极矩是所考虑分子极性的度量。电偶极矩单位为库仑米(C
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m)。一个既定非国际单位是德拜(D)。1德拜约为3.33564x 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离与多种基质结合的分析物的方法，所述方法包括：(a)用多种洗脱液洗脱所述分析物，其中第一次洗脱步骤使用包含第一编号洗脱液的组合物，随后第n次洗脱步骤使用包含第n编号洗脱液的组合物，其中与所述第一编号洗脱液相比，至少一种第n编号洗脱液具有不同偶极矩和/或不同疏水性；其中所述分析物是或包含肽、蛋白质和/或多肽；并且其中最好有至少一种所述洗脱液选自吡啶、哌啶、三乙胺、吡咯、取代吡啶和取代吡咯。2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述第n个编号洗脱液比所述第一编号洗脱液具有更低的偶极矩和/或更高的疏水性；和/或(ii)一种、多种或所有所述组合物是洗脱缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质选自强阴离子交换基质(SAX)、强阳离子交换基质(SCX)、弱阴离子交换基质(WAX)、弱阳离子交换基质(WCX)、反相(RP)基质和结合SCX/WCX和RP部分的混合相基质；强阴离子交换基质(SAX)、强阳离子交换基质(SCX)、弱阴离子交换基质(WAX)、弱阳离子交换基质(WCX)，特别优选所述混合相基质；特别优选所述混合相基质。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多种洗脱液为选自2
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96、3
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8的数字，或为3。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(i)每个洗脱步骤使用不同洗脱剂；和/或(ii)不同编号洗脱液是不同化合物或不同化合物的混合物。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(iii)相同洗脱剂至少使用两次；和/或(iv)至少两种不同编号洗脱液是相同化合物或相同化合物的混合物。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中组合物仅在编号洗脱液方面不同，和/或所述组合物没有浓度梯度和/或pH梯度。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中编号洗脱剂选自吡啶、哌啶、吡咯烷、三乙胺、3
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甲基吡啶、4
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甲基吡啶、2
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甲基吡啶、咪唑并[1，2
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a]吡啶、吡咯、N
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甲基吡咯、4
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乙烯基吡啶、2
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乙烯基吡啶、3，4
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二甲基吡啶、2，4
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二甲基吡啶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞巴斯蒂安，
申请(专利权)人：普雷奥米克斯有限责任公司，
类型：发明
国别省市：