大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法技术

本发明专利技术公开了大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法，利用双重荧光定量PCR及数字PCR对大西洋鲑鱼与虹鳟鱼成分进行检测，包括如下步骤：(1)大西洋鲑鱼与虹鳟鱼引物及其荧光探针设计与修饰；(2)样品DNA提取；(3)双重荧光定量PCR反应体系及扩增参数；(4)数字PCR反应体系及扩增参数；(5)结果判读。本发明专利技术为大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别提供了一套准确可靠的方法，特异性好，灵敏度高。另外，数字PCR可以直观读取反应体系微滴分布情况，从而判别各成分的占比。成分的占比。成分的占比。

【技术实现步骤摘要】
大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法


[0001]本专利技术涉及大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法，具体涉及利用双重荧光定量PCR及数字PCR鉴别大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分的方法。

技术介绍

[0002]大西洋鲑鱼(Salmo salar)是鲑形目、鲑科、鲑属、鲑鱼种的一类海鱼，主要分布在大西洋，即传统意义上的三文鱼。虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)是鲑形目、鲑科、太平洋鲑属、虹鳟鱼种的一类淡水鱼，主要分布于北美及太平洋西岸等地区。作为鲑形目鲑科两种重要的经济鱼类，两者具有极为相似的体型和鱼肉组织，富含蛋白质、脂肪、矿物质和维生素等营养物质，但是大西洋鲑鱼的不饱和脂肪酸相对高于虹鳟鱼的不饱和脂肪酸含量，具有更高的营养价值，更受消费者欢迎，同时，大西洋鲑鱼相对资源较少而虹鳟鱼更容易养殖，因此，在售价方面二者有着较大差异，通常大西洋鲑鱼价格是虹鳟鱼的两倍之多。
[0003]为了追求利润，市场上以虹鳟鱼冒充大西洋鲑鱼或者以三文鱼、淡水三文鱼的幌子进行销售的情况非常普遍，尤其是大西洋鲑鱼很少以鲜活的形式进行出售，大多是以加工制品的形式进行销售，如切片后的生鲜冷冻生鱼片、肉松、肉干、罐头制品和烟熏制品等，更加加剧市场上以假乱真的现象。以虹鳟鱼冒充大西洋鲑鱼不仅给消费者带来经济损失，而且存在潜在的食用安全风险，这是由于三文鱼常以生食为主，淡水养殖的虹鳟鱼较海水生存的大西洋鲑鱼而言具有更高寄生虫感染风险，因此，建立大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鉴别方法是国内外学者研究的热点，也是维护消费者权益、确保食品安全的技术支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法，涉及双重荧光定量PCR技术和数字PCR技术。两种方法是基于Taqman探针法，通过使用多对引物和相应的标记有不同的荧光信号的探针，在同一个反应体系中对两种目标序列同时检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法，利用双重荧光定量PCR及数字PCR技术对大西洋鲑鱼与虹鳟鱼成分进行检测，包括以下步骤：
[0006]S1、分别对大西洋鲑鱼线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基(CoxΙ)基因、虹鳟鱼线粒体细胞色素b(Cyt b)基因保守序片段设计上游引物、下游引物和探针，引物和探针序列如下所示；
[0007]大西洋鲑鱼线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基(CoxΙ)基因：
[0008]上游引物：5＇
‑
GACACTCGTGCCTACTTTAC
‑
3＇；
[0009]下游引物：5＇
‑
GAAGTGGCGTTTCTCATTTG
‑
3＇；
[0010]探针：5`
‑
CCATAATCATCGCCATCCCAACTGGA
‑
3＇；
[0011]虹鳟鱼线粒体细胞色素b(Cyt b)基因：
[0012]上游引物：5＇
‑
AACAAGCTGGGAGGAGTA
‑
3＇；
[0013]下游引物：5＇
‑
GTGAGTGGTCGAAAGGTAAG
‑
3＇；
[0014]探针：5`
‑
CTCGATCCTTGTCCTCATGGTTGTCC
‑
3＇。
[0015]S2、样本DNA提取：选取样本后，经剪碎或研磨、混合均匀后，采用CTAB法进行DNA提取，或采用试剂盒进行抽提；
[0016]S3、双重荧光定量PCR反应体系总量采用25μL或50μL，具体反应参数为：
[0017]第一步：95℃变性10min；
[0018]第二步：95℃变性15s，60℃退火/延伸60s并收集探针所标记的荧光信号，循环40次；
[0019]S4、双重荧光定量PCR结果判别：根据所扩增的目标基因扩增结果是否出现典型S曲线和Ct值大小判断是否含有相应的成分，当其中目标基因扩增曲线为典型S曲线且Ct值＜35，则判断样本中含有该成分，若未出现典型S曲线或Ct值≥35，则判断样本中不含有该成分。
[0020]作为上述方案的进一步地改进，所述步骤S3中的双重荧光定量PCR反应体系总量为25μL体系组成包括：荧光定量PCR反应液12.5μL，浓度为10μmol的大西洋鲑鱼线粒体coxΙ基因、虹鳟鱼线粒体Cyt b基因上游引物各1μL，浓度为10μmol的两种下游引物各1μL，浓度为10μmol的两种探针各0.5μL，加入模板DNA1
‑
5μL，补充ddH2O至25μL。
[0021]作为上述方案的进一步地改进，所述步骤S3中的双重荧光定量PCR反应体系总量为50μL体系组成包括：荧光定量PCR反应液25μL，浓度为10μmol的大西洋鲑鱼线粒体coxΙ基因、虹鳟鱼线粒体Cyt b基因上游引物各1μL，浓度为10μmol的对应两种下游引物各1μL，浓度为10μmol的两种探针各0.5μL，加入模板DNA1
‑
5μL，补充ddH2O至50μL。
[0022]作为上述方案的进一步地改进，所述步骤S1中的5＇端为FAM、HEX/VIC/JOE、NED/Cy3、Texas Red/ROX、Cy5五组中任意选择其中3组进行标记，3＇端荧光淬灭基团标记使用BHQ1、BHQ2、MGB或TAMRA进行标记。
[0023]本专利技术的有益效果为：这种大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法采用双重荧光定量PCR和/或数字PCR鉴别方法，针对大黄鱼、小黄鱼保守DNA序列片段以及鱼类通用内参基因设计引物和Taqman探针，通过使用相应的引物和相应的标记有不同的荧光信号的探针，在同一个反应体系中实现两种成分同时检测，可以互相验证，确保结果准确，此外，两种方法特异性好、灵敏度高，数字PCR可以直观读取反应体系微滴分布情况，从而判别各成分的占比。
附图说明
[0024]图1是本专利技术实施例中大西洋鲑鱼与虹鳟鱼混合DNA样品双重荧光定量PCR扩增图；
[0025]图2为本专利技术实施例中大西洋鲑鱼样品双重荧光定量PCR扩增图；
[0026]图3为本专利技术实施例中虹鳟鱼样品双重荧光定量PCR扩增图；
[0027]图4为本专利技术实施例中阴性对照样品双重荧光定量PCR扩增图；
[0028]图5为本专利技术实施例中数字PCR阴性体系微滴读取结果图；
[0029]图6为本专利技术实施例中数字PCR虹鳟鱼、大西洋鲑鱼随机混合样本微滴读取结果图；
[0030]图7为本专利技术实施例中数字PCR微滴二维散点分布图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例的附图，对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大西洋鲑鱼与虹鳟鱼鱼源性成分鉴别方法，其特征在于：利用双重荧光定量PCR及数字PCR技术对大西洋鲑鱼与虹鳟鱼成分进行检测，包括以下步骤：S1、分别对大西洋鲑鱼线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基(CoxΙ)基因、虹鳟鱼线粒体细胞色素b(Cyt b)基因保守序片段设计上游引物、下游引物和探针，引物和探针序列如下所示；大西洋鲑鱼线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基(CoxΙ)基因：上游引物：5＇
‑
GACACTCGTGCCTACTTTAC
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3＇；下游引物：5＇
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GAAGTGGCGTTTCTCATTTG
‑
3＇；探针：5`
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CCATAATCATCGCCATCCCAACTGGA
‑
3＇；虹鳟鱼线粒体细胞色素b(Cyt b)基因：上游引物：5＇
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AACAAGCTGGGAGGAGTA
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3＇；下游引物：5＇
‑
GTGAGTGGTCGAAAGGTAAG
‑
3＇；探针：5`
‑
CTCGATCCTTGTCCTCATGGTTGTCC
‑
3＇。S2、样本DNA提取：选取样本后，经剪碎或研磨、混合均匀后，采用CTAB法进行DNA提取，或采用试剂盒进行抽提；S3、双重荧光定量PCR反应体系总量采用25μL或50μL，具体反应参数为：第一步：95℃变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃退火/延伸60s并收集探针所标记的荧光信号，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵彪，陈刚，张霞，管祁，高利亭，汪少芸，徐陈红，蔡茜茜，王森，王振涛，
申请(专利权)人：南通市产品质量监督检验所，
类型：发明
国别省市：