鳖肉来源ACE抑制肽及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种鳖肉来源ACE抑制肽，包括IEWEF肽段和WK肽段，其中，IEWEF肽段的氨基酸序列为Ile

【技术实现步骤摘要】
鳖肉来源ACE抑制肽及其筛选方法


[0001]本专利技术属于生物活性肽领域。更具体地说，本专利技术涉及一种鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法。

技术介绍

[0002]肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是各种原因所致慢性肝损伤后出现的实质细胞再生、间质细胞活化增生和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积的肝组织修复重建过程，是各种慢性肝病共同的病理基础，是发展为肝硬化的必经阶段。根据2020年《全球癌症统计报告》显示，肝癌在全球癌症死亡原因中居于第三位。在肝纤维化演变成肝硬化甚至肝癌前，如何进行药物治疗，阻止病情进一步发展，成为肝癌防治研究的重点之一。
[0003]已有实验证明，肾素血管紧张素系统(Renin
‑
angiotensin system，RAS)在肝纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。肝纤维病变过程中，由血管紧张素II(Ang II)与血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)及血管紧张素II 1型受体(AT1R)组成ACE
‑
Ang II
‑
AT1R通路，会促进纤维化发展，而血管紧张素转化酶2(ACE2)会降解Ang II生成Ang(l
‑
7)，Ang(l
‑
7)作用于Mas受体发挥抗纤维化效应，即ACE2
‑
Ang(l
‑
7)
‑
Mas通路对ACE
‑
Ang II
‑
AT1R通路有反向调节作用。临床使用的ACE抑制剂卡托普利、赖诺普利、依那普利等除具备降血压功能外，它们对局部组织RAS系统的主要成分也能产生影响，抑制器官纤维化病变，但长期使用这类药物会产生明显不良反应，如干咳、皮疹、心动过速，甚至会导致肾功能下降和肺癌风险增加以及全身性低血压等不良反应。
[0004]鳖(Pelodiscus sinensis Wiegmann)为龟鳖目鳖科动物，是淡水养殖的重要品种，浙江、江苏、湖北、广西等地为主产区。自古以来，人们就认识到鳖具有较高的药用和食用价值，《中华本草》记载鳖肉具有滋阴补肾、清退虚热的功效，主治虚劳羸瘦、骨蒸痨热、久疟、久痢、崩漏、带下等症。研究人员从鳖肉酶解物中已经发现具有ACE抑制活性的组分。Chiu LH等采用胃肠消化酶对鳖肉蛋白质进行酶解，酶解产物的ACE抑制活性提高。徐怀德等利用木瓜蛋白酶对鳖肉蛋白质进行酶解并纯化，部分多肽组分具有良好的ACE抑制活性。Liu LL等用中性蛋白酶酶解鳖肉蛋白质并进行分离，其中分子量小于5KDa的超滤组分表现出较好的ACE抑制活性。
[0005]从天然蛋白质筛选分离ACE抑制肽，一般先采用酶解法对蛋白质进行酶解，以释放其中的活性肽段，再经超滤法、凝胶色谱、离子交换色谱和高效液相色谱(HPLC)等技术结合活性筛选实验进行分离纯化，以获得其中的ACE抑制肽。虽然这些技术方法在ACE抑制肽的制备过程中应用广泛，但是存在实验周期长、分离效率低等缺点。
[0006]蛋白质虚拟酶切和活性虚拟筛选技术不断发展成熟，越来越多地应用于天然蛋白质的活性肽筛选研究中。虚拟酶切是应用计算机辅助技术模拟蛋白酶对各种蛋白质酶解的过程，以高效确定蛋白质酶切位点，快速获得小分子肽段，如BIOPEP和Peptide Cutter均能够预测蛋白酶的潜在切割位点。活性虚拟筛选则是一种非常成熟的研究策略，利用计算机进行化合物活性的虚拟评价，以高效获得有生物活性的小分子，包括基于小分子的或基于
蛋白质靶点的筛选方法。
[0007]Shotgun技术是针对复杂混合物中蛋白质的一种分析鉴定方法，它结合了HPLC技术和质谱技术，能够达到尽可能完整分析所有蛋白质信息的效果，而以Shotgun技术分析所得蛋白质信息为基础进行虚拟酶切研究，有利于更准确地定位活性肽段。
[0008]综上，利用Shotgun技术结合蛋白质虚拟酶切和活性虚拟筛选，将能更加快速、高效寻找鳖肉来源的新的ACE抑制肽，这对高血压及肝纤维化疾病的治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0009]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0010]本专利技术一个目的是提供一种鳖肉来源ACE抑制肽，其与ACE的结合紧密，对ACE具有较强的抑制作用。
[0011]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种鳖肉来源ACE抑制肽，包括IEWEF肽段和WK肽段，其中，IEWEF肽段的氨基酸序列为Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑
Glu
‑
Phe，WK肽段的氨基酸序列为Trp
‑
Lys。
[0012]一种鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法，其包括以下步骤：
[0013]1)将鳖肉水溶蛋白进行鸟枪法(Shotgun)分析，然后对鸟枪法分析鉴定出的蛋白质进行虚拟酶切，筛选出虚拟酶解最优酶；
[0014]2)利用筛选出的虚拟酶解最优酶对鉴定出的蛋白质进行虚拟酶切，预测各酶酶切所得的ACE抑制肽理论释放量，并以ACE抑制肽理论释放量为评价指标，分析每种蛋白质虚拟酶解的最优酶，统计各最优酶对应的蛋白数量，利用活性虚拟筛选工具并结合ADMET性质评价以及数据库检索，筛选新的ACE抑制肽。
[0015]优选的是，鳖肉水溶蛋白的制备包括以下步骤：将鳖宰杀、放血后，去除其内脏及附带筋皮，捣碎鳖肉组织制成肉糜，冻干备用；称取冻干的鳖肉肉糜按照1：10～15(g/mL)的物料比，加入纯水，室温下搅拌提取2～4h后以2000
×
g离心20～30min，相同条件下重复提取2～3次，收集离心后的上清液，获得鳖肉水溶蛋白。
[0016]优选的是，对鳖肉水溶蛋白进行胰蛋白酶酶切、离心、脱盐、冻干的前处理操作后，进行LC
‑
MS/MS分析以鉴定蛋白质。
[0017]优选的是，进行LC
‑
MS/MS分析的方法为：采用钠升级流速HPLC液相系统Easy
‑
nLC系统进行分离；
[0018]所用的缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液；色谱柱以95％的A液平衡，色谱柱为Thermo scientific EASY column，再经分析柱Thermo scientific EASY column分离，流速为300nL/min；
[0019]液相梯度如下：0～110min，B液梯度从0％～55％；110～115min，B液梯度从55％～100％，115～120min，B液100％；肽段经色谱分离后使用Q
‑
Exactive质谱仪进行分析；分析时长：120min；检测方式：正离子；母离子扫描范围：300～1800m/z；
[0020]蛋白数据库为uniprot_Pelodiscus_sinensis_本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鳖肉来源ACE抑制肽，其特征在于，包括IEWEF肽段和WK肽段，其中，IEWEF肽段的氨基酸序列为Ile
‑
Glu
‑
Trp
‑
Glu
‑
Phe，WK肽段的氨基酸序列为Trp
‑
Lys。2.如权利要求1所述的鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将鳖肉水溶蛋白进行鸟枪法分析，然后对鸟枪法分析鉴定出的蛋白质进行虚拟酶切，预测各酶酶切所得的ACE抑制肽理论释放量，并以ACE抑制肽理论释放量为评价指标，分析每种蛋白质虚拟酶解的最优酶，统计各最优酶对应的蛋白数量，筛选出虚拟酶解最优酶；2)利用筛选出的虚拟酶解最优酶对鉴定出的蛋白质进行虚拟酶切，利用活性虚拟筛选工具并结合ADMET性质评价以及数据库检索，筛选新的ACE抑制肽。3.根据权利要求2所述的鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法，其特征在于，鳖肉水溶蛋白的制备包括以下步骤：将鳖宰杀、放血后，去除内脏及附带筋皮，捣碎鳖肉组织制成肉糜，冻干备用；往冻干鳖肉肉糜加入纯水，冻干鳖肉肉糜的质量与纯水的体积比为1：10～15，室温下搅拌提取2～4h后以2000
×
g离心20～30min，相同条件下重复提取2～3次，收集离心后的上清液，冷冻干燥，获得鳖肉水溶蛋白。4.根据权利要求2所述的鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法，其特征在于，对鳖肉水溶蛋白进行胰蛋白酶酶切、离心、脱盐、冻干的前处理操作后，进行LC
‑
MS/MS分析以鉴定蛋白质。5.根据权利要求4所述的鳖肉来源ACE抑制肽的筛选方法，其特征在于，进行LC
‑
MS/MS分析的方法为：采用钠升级流速HPLC液相系统Easy
‑
nLC系统分离肽段，所用的缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液；色谱柱以95％的A液平衡，色谱柱为Thermo scientific EASY column，再经分析柱Thermo scientific EASY column分离，流速为300nL/min；液相梯度如下：0～110min，B液梯度从0％～55％；110～115min，B液梯度从55％～100％，115～120min，B液100％；肽段经色谱分离后使用Q
‑
Exactive质谱仪进行分析；分析时长：120min；检测方式：正离子；母离子扫描范围：300～1800m/z；蛋白数据库为uniprot_Pelodiscus_sinensis_...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖彭莹，孙雪芹，陈俊，刘华宇，刘舒凌，李锦清，陈海平，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：