猪瘟抗体和检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟抗体和检测试剂盒，抗体包括Fab、scFv和IgG，IgG为抗猪IgG

【技术实现步骤摘要】
猪瘟抗体和检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及噬菌体展示单克隆抗体制备
，特别涉及猪瘟抗体和检测试剂盒。

技术介绍

[0002]猪瘟也称猪霍乱，是一种以多系统出血为特征的猪烈性传染病，可引起猪只发热、死亡，损害猪只生产性能，造成经济损失，无论是在流行地区、地方性流行区或已消除猪瘟的地区，都是危害或威胁养猪业的一种重要疾病。
[0003]猪瘟疫情在发生后，解决手段包括采取全面扑杀病畜及可疑猪只的措施、采取疫苗免疫和扑杀共同作用的方法和采取强制免疫猪瘟疫苗的防控方法，目前在生产中广泛应用的猪瘟疫苗主要有两种，一种是传统的活体病毒苗，一种是E2囊膜糖蛋白亚单位疫苗。
[0004]但是E2疫苗无法为先天感染提供强有力的保护，且此种疫苗的免疫机制尚未完全明晰，因此如何快速、大规模的实现快速检测猪瘟感染，以及如何大规模检测疫苗免疫有效性是必要的，为此，本专利技术提出一种猪瘟抗体和检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供猪瘟抗体和检测试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：猪瘟抗体，包括Fab、scFv和I gG，所述I gG为抗猪I gG
‑
HRP二抗，所述抗体的可变区下游分别连入轻链恒定区序列和重链恒定区，且转染293F细胞，进行无血清发酵后，使用蛋白G柱纯化抗体并用UV定量，所述抗体与E2蛋白结合的有六组，分别为：MB001、MB016、MB021、MB0056、MB057和MB113；
[0007]所述MB001的CDR序列包括CDR
‑
L1：RASEN IYSYLA、CDR
‑
L2：NAKTLAE、CDR
‑
L3：QHHYGTPYT、CDR
‑
H1：DYEMH、CDR
‑
H2：AIYPETGGTAYNQKFKG和CDR
‑
H3：QTGFYGGYSLDY；
[0008]所述MB016的CDR序列包括CDR
‑
L1：RASEN IYSYLS、CDR
‑
L2：NAKTLPE、CDR
‑
L3：QHHYGTPYT、CDR
‑
H1：DYEMH、CDR
‑
H2：AIYPETGGTAYNQKFKG和CDR
‑
H3：QAGFYGTYSLDY；
[0009]所述MB021的CDR序列包括CDR
‑
L1：RSSQSLVHSNGNTYLH、CDR
‑
L2：KVSNRFS、CDR
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L3：SQSTHVPLT、CDR
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H1：DYEMH、CDR
‑
H2：AI DPETGGTAYNQKFKG和CDR
‑
H3：GGNYVVYYAMDY；
[0010]所述MB056的CDR序列包括CDR
‑
L1：SASSS I SYMH、CDR
‑
L2：DTSKLAS、CDR
‑
L3：HQRSSYPT、CDR
‑
H1：TYAMN、CDR
‑
H2：RI RSKSNNYATYYADSVKD和CDR
‑
H3：NLDY；
[0011]所述MB057的CDR序列包括CDR
‑
L1：KASQD I NSYLS、CDR
‑
L2：RANRLVD、CDR
‑
L3：LQYDEFPYT、CDR
‑
H1：DYI ML、CDR
‑
H2：N I NPYYGSTSYNLKFKG和CDR
‑
H3：SGDGFSFAY；
[0012]所述MB113的CDR序列包括CDR
‑
L1：RASSSVSYMH、CDR
‑
L2：ATSNLAS、CDR
‑
L3：QQWSSNPYT、CDR
‑
H1：DYEMH、CDR
‑
H2：AI DPETGGTAYNQKFKG和CDR
‑
H3：QAGFYDGYSLDY。
[0013]猪瘟抗体检测试剂盒，包括包被的E2酶标板、2％BSA封闭的空白板、PBST洗液、ant i
‑
M13 HRP标记二抗、TMB显色液和硫酸，所述包被的E2酶标板是采用96孔酶标板50ng，且每
孔包被E2，所述2％BSA封闭的空白板作为对照板。
[0014]优选的，所述包被的E2酶标板的制备方法包括以下几个步骤；
[0015]步骤一，进行小鼠脾脏的采集，所述采集的脾脏为进行多次免疫的小鼠脾脏；
[0016]步骤二，进行总RNA的提取，提取步骤一采集的小鼠脾脏的总RNA；
[0017]步骤三，构建抗体可变区PCR及噬菌粒载体，将步骤二提取的总RNA使用微量分光光度计定量后，以505L反转录体系进行反转录，并将PCR获得的抗体重轻链拼接片段和pCom3向量表达载体酶切消化后，按照T4连接酶使用说明书进行过夜连接，得到复苏后的菌液；
[0018]步骤四，进行文库扩增与浓缩，将步骤三中得到的复苏后的菌液加入含氨苄、四环素和2％葡萄糖的2YT培养基中进行扩增和浓缩；
[0019]步骤五，进行抗原包被和细胞准备，将E2蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/mL，按照每孔100μL加入可拆卸96孔酶标板中，根据筛选过程所需细胞数量按需传代扩增备用；
[0020]步骤六，进行文库筛选与再扩增，取步骤四中浓缩文库进行筛选和再扩增，获得2nd筛选扩增的文库。
[0021]优选的，所述小鼠脾脏的采集的具体步骤为以纯化获得的E2蛋白为免疫原，选取6
‑
8周龄健康Ba l b/c小鼠进行免疫，首次免疫使用E2蛋白按照20μg/只剂量与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，背部多点皮下注射免疫小鼠；
[0022]第一次免疫后，每隔14d，用E2蛋白20μg/只与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，背部多点皮下注射免疫小鼠，共免4次，间接EL I SA测定小鼠血清抗体效价，当效价达到243000倍稀释度，小鼠腹腔注射50μgE2蛋白加强免疫4天后采集脾脏。
[0023]优选的，所述总RNA的提取的具体步骤为采集新鲜脾脏加液氮在研钵中碾磨，直到形成粉末状，取适量加入Tr i zo l中，迅速充分混匀，用匀浆机打碎3—5次；
[0024]室温静置5mi n后，每个样品取1m l依次分别加入到2个1.5m l EP管中，加200μL氯仿到1.5m l EP管中，盖紧样品管盖；
[0025]用手摇晃试管1mi n，后静置5mi n，每管取上清约3505L，两管上清并为一管，得到600
‑
7005L的上清；
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪瘟抗体，包括Fab、scFv和IgG，其特征在于，所述IgG为抗猪IgG
‑
HRP二抗，所述抗体的可变区下游分别连入轻链恒定区序列和重链恒定区，且转染293F细胞，进行无血清发酵后，使用蛋白G柱纯化抗体并用UV定量，所述抗体与E2蛋白结合的有六组，分别为：MB001、MB016、MB021、MB0056、MB057和MB113；所述MB001的CDR序列包括CDR
‑
L1：RASENIYSYLA、CDR
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L2：NAKTLAE、CDR
‑
L3：QHHYGTPYT、CDR
‑
H1：DYEMH、CDR
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H2：AIYPETGGTAYNQKFKG和CDR
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H3：QTGFYGGYSLDY；所述MB016的CDR序列包括CDR
‑
L1：RASENIYSYLS、CDR
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L2：NAKTLPE、CDR
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L3：QHHYGTPYT、CDR
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H1：DYEMH、CDR
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H2：AIYPETGGTAYNQKFKG和CDR
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H3：QAGFYGTYSLDY；所述MB021的CDR序列包括CDR
‑
L1：RSSQSLVHSNGNTYLH、CDR
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L2：KVSNRFS、CDR
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L3：SQSTHVPLT、CDR
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H1：DYEMH、CDR
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H2：AIDPETGGTAYNQKFKG和CDR
‑
H3：GGNYVVYYAMDY；所述MB056的CDR序列包括CDR
‑
L1：SASSSISYMH、CDR
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L2：DTSKLAS、CDR
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L3：HQRSSYPT、CDR
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H1：TYAMN、CDR
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H2：RIRSKSNNYATYYADSVKD和CDR
‑
H3：NLDY；所述MB057的CDR序列包括CDR
‑
L1：KASQDINSYLS、CDR
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L2：RANRLVD、CDR
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L3：LQYDEFPYT、CDR
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H1：DYIML、CDR
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H2：NINPYYGSTSYNLKFKG和CDR
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H3：SGDGFSFAY；所述MB113的CDR序列包括CDR
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L1：RASSSVSYMH、CDR
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L2：ATSNLAS、CDR
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L3：QQWSSNPYT、CDR
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H1：DYEMH、CDR
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H2：AIDPETGGTAYNQKFKG和CDR
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H3：QAGFYDGYSLDY。2.猪瘟抗体检测试剂盒，其特征在于，包括包被的E2酶标板、2％BSA封闭的空白板、PBST洗液、anti
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M13 HRP标记二抗、TMB显色液和硫酸，所述包被的E2酶标板是采用96孔酶标板50ng，且每孔包被E2，所述2％BSA封闭的空白板作为对照板。3.根据权利要求2所述的猪瘟抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被的E2酶标板的制备方法包括以下几个步骤；步骤一，进行小鼠脾脏的采集，所述采集的脾...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺建望，谢朋辉，
申请(专利权)人：艾柏森江苏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：