可识别和中和MERS-CoV的多肽NbM14及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可识别和中和MERS

【技术实现步骤摘要】
可识别和中和MERS
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CoV的多肽NbM14及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可结合MERS
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CoV的多肽，还涉及所述多肽在制备MERS
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CoV感染的治疗药物和诊断剂中的应用。

技术介绍

[0002]中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome,MERS)首先发现于2012年6月一名死亡的60岁沙特阿拉伯男性患者。该病的潜伏期为2至14天，典型表现为急性呼吸道感染，起病急，高热(39
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40℃)，可伴有畏寒、寒战、咳嗽、胸痛、头痛、全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等症状。目前尚无可用的疫苗和特异性治疗方法。虽然该病最初发生在中东地区，但随着贸易、旅游等的活动的开展，逐渐蔓延到欧洲、非洲、亚洲和北美洲等27个国家。因此，针对MERS的病原体开发安全有效的中和抗体在该疫情的防控中有重要的公共卫生意义。
[0003]引起MERS的病原体是MERS
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CoV，属于β冠状病毒属(β
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CoV)，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。MERS
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CoV的单链RNA基因组的大小约30kb,共有10个开放阅读框(ORF)，编码16种非结构蛋白(nsp1
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16)和四种结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。这四种结构蛋白组成球形、似王冠样病毒颗粒，其中S和N具有很强的免疫原性。S蛋白为三聚体状态的Ⅰ型跨膜糖蛋白，位于病毒膜表面，介导病毒附着宿主细胞及病毒
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细胞膜的融合，是细胞靶向性和发病机制的主要决定因子。S蛋白能够诱导机体产生中和抗体，该抗体在预防MERS
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CoV感染中发挥关键作用。因此，以S蛋白免疫动物，并从中筛选有中和活性的抗体将是治疗MERS
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CoV感染的有效策略之一。
[0004]1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(CH2和CH3)、一个铰链区和一个重链可变区(Variable heavy chain domain，VHH，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13KDa，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(Nanobody，Nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗，用于检测和治疗MERS
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CoV感染。基于这些研究，本专利技术提供了一种可结合MERS
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CoV的多肽，包括3个互补决定区CDR1
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3，序列如SEQ ID NO:1
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3所示。
[0006]在一个具体实施方案中，所述多肽为纳米抗体。
[0007]在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区FR1
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4，所述FR1
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4与所述CDR1
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3按顺序交错排列。例如，可将FR1
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4序列设计为如SEQ ID NO:4
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7所示(羊驼源)，但本
专利技术的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由CDR区序列决定，FR序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的FR区序列来连接上述CDR，从而得到一个可结合CD4的纳米抗体。
[0008]在一个具体实施方案中，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的VHH。
[0009]本专利技术还提供了上述多肽在制备MERS
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CoV的检测剂或MERS
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CoV的S蛋白的检测剂中的应用。
[0010]本专利技术还提供了上述多肽在制备MERS
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CoV治疗药物中的应用。
[0011]本专利技术还提供了编码上述多肽的核酸。
[0012]本专利技术还提供了上述核酸在制备MERS
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CoV治疗药物中的应用。
[0013]本专利技术针对MERS
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CoV进行纳米抗体药物开发，通过制备MERS
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CoV S蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合MERS
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CoV的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH
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huFc1；同时利用假病毒中和实验评估NbM14在治疗MERS
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CoV感染的疗效，为MERS
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CoV感染的防治提供了潜在的检测剂和治疗药物。
附图说明
[0014]图1为MERS
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CoV
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S蛋白第4次免疫羊驼一周后的抗血清效价检测曲线。
[0015]图2为不同稀释度的第4次免疫骆驼一周后的抗血清抑制MERS
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CoV假病毒体外感染ghost细胞的曲线，以免疫前的血清为对照。
[0016]图3为MERS
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VHH噬菌体抗体文库的淘选鉴定，其中，A为噬菌体文库针对MERS
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CoV
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S蛋白淘选后ELISA检测统计图；B为从第一轮(1
st
)第二轮(2
nd
)和第三轮(3
rd
)淘选后的噬菌体抗体文库各挑选24,24个和40个克隆进行噬菌体ELISA检测统计图。
[0017]图4为原核表达的VHH抗体的ELISA检测统计图，每个点代表一个克隆，纵坐标为针对S蛋白的OD450/空白对照的OD450，比值大于5.0定义为阳性。
[0018]图5为NbM14抗体的SPR检测统计图。
[0019]图6为ELISA检测不同纯化浓度的NbM14抗体与MERS
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S蛋白结合的OD450统计图。
[0020]图7为NbM14抗体中和MERS
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CoV假病毒感染实验曲线图。
具体实施方式
[0021]1.羊驼免疫与抗血清的获得
[0022]用250μg MERS
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S蛋白与250μl弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，在第14天、28天、42天用MERS
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S蛋白与250μl弗氏不完全佐剂加强免疫3次，第2次和第3次免疫1周后，采血检测抗血清滴度；第4次免疫1周后，采血200ml用于噬菌体抗体库的构建。
[0023]抗血清效价通过ELISA检测，用浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可结合MERS
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CoV的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区CDR1
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3，序列如SEQ ID NO:1
‑
3所示。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为纳米抗体。3.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，还包括4个框架区FR1
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4，所述FR1
‑
4与所述CDR1
‑
3按顺序交错排列。4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽为骆驼源的VHH或人源化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴喜林，朱林静，吴稚伟，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：