一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8拮抗剂中的应用，所述小鼠味蕾组织生物传感器是以丝网印刷电极为检测器件，小鼠味蕾组织膜为辨识原件，构建小鼠味蕾组织生物传感器，该组织生物传感器方法灵敏度高，特异性强，所需样品体积小，检测浓度低至10

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用


[0001]本专利技术属于中药领域，具体涉及一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用。

技术介绍

[0002]TRP通道是电压门控阳离子通道，能感知光线、温度、触觉、疼痛、味觉等刺激，其中热激活通道包括TRPV1
‑
4，冷激活通道包括TRPM8和TRPA1。TRP离子通道与中药的药性—辛温、辛凉有一定的关联，许多来源于辛味中药的天然化合物可以调节TRP通道，因此针对TRP通道的研究可在一定程度上解释中药药性的科学内涵。TRPM8是研究较多的TRP通道之一，是一种冷激活的温觉TRP通道，分布于背根神经节和三叉神经的感觉神经元。TRPM8通道可被多种刺激激活，其中包括一定的低温(8
‑
26℃)以及冷却剂，比如WS
‑
3、薄荷醇、等激活剂。TRPM8的激动剂和拮抗剂都已被研究用于各种治疗，TRPM8拮抗剂作为治疗神经性疼痛、炎症、偏头痛和癌症的潜在药物。但大多数TRPM8拮抗剂缺乏对TRPM8的选择性，可与TRPV1和TRPA1相互作用。因此，对于TRPM8受体拮抗剂需进行特异性筛选。此外，关于对TRPM8受体激动剂和拮抗剂的研究可以进一步扩大对TRPM8受体功能的探索。
[0003]生物传感器是快速筛选具有高灵敏度和特异性的生物靶标的宝贵工具，对于拮抗剂的识别与筛选，组织生物传感器为激动剂与拮抗剂的相互作用的识别提供了技术支持。小鼠味蕾组织生物传感器是以修饰在丝网印刷电极上的由小鼠味蕾组织构成的生物膜为辨识原件，味蕾组织来源于舌头，舌头是收集物质味道信息的关键器官，感受味觉的基本单元是味蕾，味蕾由味觉受体细胞、基底细胞和支持细胞组成，味觉受体主要与甘、鲜、苦、辛等感受相关，当味蕾上的味觉受体与配体结合后，产生味觉信号，传递到大脑味觉中心，因此味蕾细胞和大脑味觉中心之间的信号传递具有较高特异性。舌头上的化学刺激、热刺激和触觉刺激等会引起感觉神经纤维的反应，与味觉乳头中味觉细胞上的味觉受体相互作用，进而激活与味觉细胞形成突出的神经纤维，其中TRPM8存在于支配舌头的感觉神经纤维中。而且味觉黏膜上皮组织在被剥离后的一段时间内仍保持正常功能，味觉受体细胞仍能保持对味觉物质的有效活性。此外，丝网印刷电极(SPE)是基于丝网印刷技术的一次性传感器，可以将组织、酶、抗原、抗体、核酸修饰在电极上，制成酶、抗体和基因传感器等，因其具有高灵敏度和选择性，以及较低的检测限，且允许进行大量实验，所需样品体积小，无需电极预处理和维护，被广泛用于制药、临床试验和食品工业中。本专利技术构建的小鼠味蕾组织生物传感器信号是由TRPM8受体激动剂与拮抗剂结合而产生，因此基于丝网印刷电极的生物传感器可提供可靠的结果。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的缺点与不足，扩大组织生物传感器的检测范围，提高对受体的特异性选择，灵敏筛选TRPM8受体拮抗剂，本专利技术的首要目的在于提供一种小鼠味蕾组织
生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用方法。
[0005]一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用，具体包括以下步骤：
[0006](1)小鼠味蕾组织传感器的构建：
[0007]将可溶性淀粉溶解于1％
‑
5％的海藻酸钠的戊二醛溶液中，制得海藻酸钠淀粉胶溶液，用海藻酸钠淀粉胶溶液把小鼠味蕾组织固定于两张微孔滤膜之间，形成三明治结构的生物组织膜；将制备好的组织膜浸入CaCl2溶液后，并固定于丝网印刷工作电极上，小鼠味蕾组织传感器构建完成。
[0008](2)小鼠味蕾组织传感器的构建的参数优化：
[0009]以CV法为小鼠味蕾组织传感器参数优化检测方法，检测电压范围为
‑
0.4
‑
0.7V，以辣椒素溶液为测试样品，分别以水、PBS、K3[Fe(CN)6]水溶液、K3[Fe(CN)6]PBS溶液、KCl
‑
5mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]溶液、KCl
‑
10mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]溶液为工作液进行测试，由图1(A)可知KCl
‑
10mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]溶液为工作液时响应电流最大；当以KCl
‑
10mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]溶液为工作液时，分别在扫描速率为25、50、75、100、125、150、175mV进行检测，由图1(B)可知，选择50mV作为扫描速率；以KCl
‑
10mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]溶液为工作液，扫描速率50mV，分别在扫描间隔为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.10V/s进行测试，由图1(C)可知，选择0.01V/s作为扫描间隔。
[0010](3)TRPM8激动剂溶液浓度细化的确定：
[0011]精密称取TRPM8激动剂WS
‑
3标准品(分子量211.344)1.1mg于5mL的容量瓶中，用KCl
‑
10mmol
·
L
‑1K3[Fe(CN)6]混合溶液定容，混匀，即得浓度约为1
×
10
‑3mol
·
L
‑1的WS
‑
3溶液；按10倍浓度梯度稀释，得到1
×
10
‑
22
‑1×
10
‑4mol
·
L
‑1的WS
‑
3溶液；以制备好的小鼠味蕾组织生物传感器为反应器件加入空白溶液以及浓度由低到高的WS
‑
3溶液，采用电化学工作站记录电流强度，如图2(A)所示；以WS
‑
3溶液浓度(C)为横坐标，以电流变化率(ΔI)为纵坐标，进行拟合，结果如图2(B)所示。由图可知，当浓度范围为1
×
10
‑
21
‑1×
10
‑
19
mol/L时，有良好线性关系，由此根据此浓度细分浓度为1
×
10
‑
21
、2
×
10
‑
21
、4
×
10
‑
21
、6
×
10
‑
21
、8
×
10
‑
21
、1
×
10
‑
20
、2
×
10
‑
20
、4
×
10
‑
20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠味蕾组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用，其特征在于，包括一种小鼠味蕾组织生物传感器，该组织生物传感器是以丝网印刷电极为检测器件，以小鼠味蕾组织膜为辨识原件；还包括此组织生物传感器在筛选TRPM8受体拮抗剂中的应用。2.根据权利要求1任一所述的一种小鼠味蕾组织生物传感器的应用，其特征在于，具体步骤如下：步骤1：将小鼠味蕾组织放置于两张微孔滤膜之间，用海藻酸钠淀粉胶溶液进行固定，形成三明治结构的生物组织膜；步骤2：将制备好的组织膜浸入CaCl2溶液后，固定在丝网印刷工作电极上，组织传感器构建完成，并进行检测参数优化；步骤3：采用步骤2中的小鼠味蕾组织传感器，依次加入空白溶剂和浓度由低到高的TRPM8激动剂溶液，采用电化学工作站记录电极间的电流强度；步骤4：以TRPM8激动剂溶液的浓度为横坐标，以电流变化率为纵坐标，进行拟合，确定WS
‑
3溶液进一步细分的浓度范围；在细分的不同浓度的TRPM8激动剂溶液中加入固定浓度的备选拮抗剂，以混合液的浓度为横坐标，响应电流变化率为纵坐标，进行双曲线拟合，通过动力学方程的拟合确定TRPM8拮抗剂对TRPM8激动剂的动力学过程；步骤5：以TRPM8激动剂与拮抗剂混合溶液浓度的倒数为横坐标，以响应电流变化率的倒数为纵坐标，绘制双倒数曲线，计算拮抗剂对TRPM8激动剂的抑制常数，并根据酶促动力学原理判断拮抗剂对TRPM8受体的拮抗类型。3.根据权利要求1所述的一种小鼠味蕾组织生物传感器的应用，其特征在于，所述的海藻酸钠淀粉胶溶液的质量分数为1％
‑
5％，通过可溶性淀粉与1％
‑
5％的海藻酸钠的戊二醛溶液混合制成。4.根据权利要求1所述的一种小鼠味蕾组织生物传感器的应用，其特征在于，权利要求2步...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志生，王静，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：