心肌细胞的精制方法技术

本发明专利技术提供一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂(其中，不包括EGF受体抑制剂。)接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；和(2)培养该细胞群的步骤。骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】心肌细胞的精制方法


[0001]本专利技术涉及一种心肌细胞的制造方法及精制方法，更详细而言，涉及一种使用受体酪氨酸激酶抑制剂制造心肌细胞的方法及精制方法。

技术介绍

[0002]近年来，心肌梗塞的发病率虽然逐渐减少，但包括心肌梗塞在内的心脏疾病仍然是世界范围内主要的死亡原因。心脏移植是目前严重心力衰竭患者唯一的治疗方法，但心脏移植存在供体不足的问题。因而，使用心肌细胞的细胞疗法作为改善心脏疾病的治疗方法备受注目。另外，使用心肌细胞的体外药效评价试验或者药剂安全性试验的建立也受到关注。因此，要求稳定供应能够用于细胞疗法及体外试验的均匀的心肌细胞。
[0003]作为稳定提供均匀的心肌细胞的方法之一，可列举从干细胞或心肌祖细胞分化诱导心肌细胞的方法，为了建立有效的心肌细胞分化诱导法，进行了各种努力。作为该分化诱导法，报道了通过在包含EGFR抑制剂的培养基中培养多能干细胞来促进多能干细胞向心肌细胞的分化诱导的方法(专利文献1)；将人工多能干细胞向心肌细胞分化诱导之后，使该心肌细胞和Neuregulin1的拮抗剂或ErbB的拮抗剂接触，从而使心肌细胞成熟的方法(专利文献2)；通过使成肌细胞等未分化祖细胞和去乙酰化酶抑制剂接触，促进该未分化祖细胞的分化诱导的方法(专利文献3)；通过使心肌祖细胞等成体的祖细胞和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂接触，促进该祖细胞的分化诱导的方法(专利文献4)等。另外，还报道了不经过从干细胞的分化诱导过程的方法，例如，专利文献5中公开了通过直接重编程由成纤维细胞等体细胞制造心肌祖细胞或心肌细胞的方法。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1：国际公开第2014/136519号
[0007]专利文献2：美国公开第2010/0183565号
[0008]专利文献3：国际公开第2003/033678号
[0009]专利文献4：国际公开第2009/073618号
[0010]专利文献5：国际公开第2015/038704号

技术实现思路

[0011]专利技术要解决的问题
[0012]本专利技术的课题在于提供一种通过与上述现有的方法不同的方式制造包含高纯度心肌细胞的细胞群的方法。另外，其课题还在于提供一种由包含心肌细胞的细胞群高纯度精制心肌细胞的方法。
[0013]用于解决课题的手段
[0014]本专利技术的专利技术人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果得出了如下构思：不是促进由未分化细胞成为心肌细胞的分化诱导，而是通过靶向已包含心肌细胞的细胞群中的
心肌细胞以外的细胞中高表达的蛋白质的抑制剂，抑制该心肌细胞以外的细胞的增殖或者减少心肌细胞以外的细胞的数量，从而增加该细胞群中的心肌细胞的比例，即精制心肌细胞。因而，首先，使用包含由iPS细胞分化诱导的心肌细胞的细胞群，进行单细胞RNA序列分析，将该细胞群中的细胞聚类。聚类结果发现，心肌细胞和此外的其它细胞中受体酪氨酸激酶的表达存在差异。因而，使用针对受体酪氨酸激酶的抑制剂验证心肌细胞在细胞群中所占的比例的变化，结果发现，通过受体酪氨酸激酶抑制剂能够成功地纯化心肌细胞。本专利技术的专利技术人基于该见解进一步反复研究，最终完成了本专利技术。
[0015]解决问题的方法
[0016]即，本专利技术提供以下内容。
[0017][1]一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括下述步骤：
[0018](1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂(其中，不包括EGF受体抑制剂。)接触的步骤，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；及
[0019](2)培养该细胞群的步骤。
[0020][2]根据[1]所述的方法，其中，上述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触在多能干细胞分化诱导开始后第4天之后进行。
[0021][3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触进行1天以上。
[0022][4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，上述抑制剂是针对选自VEGF受体、PDGF受体、HGF受体及FGF受体中的至少一种受体酪氨酸激酶的抑制剂。
[0023][5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述抑制剂为选自N
‑
[5
‑
({2
‑
[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2
‑
b]哒嗪
‑6‑
基}氧基)
‑2‑
甲基苯基]‑
1,3
‑
二甲基
‑
1H
‑
吡唑
‑5‑
甲酰胺、N
‑
{4
‑
[(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氧基]‑3‑
氟苯基}
‑
N
’‑
(4
‑
氟苯基)环丙烷
‑
1,1
‑
二甲酰胺、AMG337、ASP5878、BGJ398、福瑞替尼(Foretinib)、ZM323881、CP
‑
673451、克莱拉尼(Crenolanib)及克唑替尼(Crizotinib)中的至少一种。
[0024][6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，上述多能干细胞为人工多能干细胞。
[0025][7]一种细胞群，其包含通过[1]～[6]中任一项所述的方法得到的心肌细胞。
[0026][8]一种细胞移植治疗剂，其含有[7]所述的细胞群而成。
[0027][9]一种精制心肌细胞的方法，其包括下述步骤：
[0028](1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的工序，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；及
[0029](2)培养该细胞群的步骤。
[0030]专利技术的效果
[0031]根据本专利技术，提供一种高纯度包含心肌细胞的细胞群。该细胞群能够适用于针对心脏疾病的细胞移植疗法。另外，还提供一种从包含心肌细胞及心肌祖细胞的细胞群中高纯度精制心肌细胞的方法。
附图说明
[0032]图1示出从由iPS细胞分化诱导来的心肌细胞的单细胞RNA测序数据获得的聚类的t
‑
SNE图、及各集群(cluster)的肌节
‑
α
‑
辅肌动蛋白(sarcomeric
‑
α
‑
辅肌动蛋白)和cTnT(心肌肌钙蛋白T，Cardiac Troponin T)的表达量。上方的图中由圆圈围成的部分表示非心肌细胞群。中央和下方的图的纵轴表示基因表达量，横轴的一致性(identity)的标签表示图1的集群的编号。各点表示各个细胞，方框围成的部分表示非心肌细胞集群。
[0033本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制造包含心肌细胞的细胞群的方法，其包括：(1)使包含心肌细胞或心肌祖细胞与其它细胞的细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂接触的步骤，其中，所述受体酪氨酸激酶抑制剂不包括EGF受体抑制剂，该细胞群是将多能干细胞在心肌细胞分化用培养基中培养得到的；和(2)培养该细胞群的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触在多能干细胞分化诱导开始后第4天进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(1)中细胞群与受体酪氨酸激酶抑制剂的接触进行1天以上。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是针对选自VEGF受体、PDGF受体、HGF受体和FGF受体中的至少一种受体酪氨酸激酶的抑制剂。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂为选自N
‑
[5
‑
({2
‑
[(环丙烷羰基)氨基]咪唑并[1,2
‑
b]哒嗪
‑6‑
基}氧基)
‑2‑
甲基苯基]
‑
1,3
‑
二甲基
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田善纪，渡边幸造，田中礼，
申请(专利权)人：千纸鹤治疗公司，
类型：发明
国别省市：