基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物传感技术领域，提供一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法，以富T的功能核酸（Thymidine Rich Oligonucleotide，TRO）作为Hg

【技术实现步骤摘要】
基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法


[0001]本专利技术涉及一种水中汞离子的检测方法，尤其是一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法，实现Hg
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定量检测。

技术介绍

[0002]重金属污染是当前重要的环境问题，汞是一种毒性较强的重金属离子，其严重损害人体中枢神经系统，导致许多严重的健康问题，如脑损伤、肾衰竭以及各种认知和运动障碍。天然水体中最常见的有毒汞为水溶性二价汞离子(Hg
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)，许多国家及组织都制定了饮用水中 Hg
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的最高限量标准。现有的Hg
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检测技术，如原子吸收法、色谱法、光谱法、电耦合等离子质谱法（ICP
‑
MS）和电化学方法等，被广泛应用于环境中Hg
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检测中，但是这些检测方法对操作人员的专业性要求较高，很大程度上依赖于实验室大型设备，难以实现实时测量，无法对突发污染事件做出快速响应。因此，发展简单、快速、高灵敏度、低成本的重金属检测技术对保护环境和人类健康具有重要的理论和实用价值。
[0003]近年来，基于有机小分子、DNA酶、寡核苷酸、聚合物及纳米粒子的探针技术被应用于Hg
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检测。在众多研究中，基于T
‑
Hg
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‑
T配位结构的Hg
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检测技术以其快捷、高灵敏、低成本、高稳定性等显著优点，为Hg
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检测技术提供了新的思路。为进一步提高Hg
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检测的灵敏度，科研工作者们利用Hg
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可与富T功能核酸序列相互作用这一特性，结合成熟的荧光检测技术，发展了多种Hg
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检测方法。然而，荧光检测方法的优良特性也取决于新的荧光探针的选择，其实际应用中会面临探针材料的选择、体系易受环境因素干扰、稳定性较差、灵敏度低等问题。如公开号为CN 107436297 A的文献公布了“基于发夹式DNA探针的水中汞离子检测方法
”ꢀ
，该文献设计了一条两端双标荧光染料的富T序列发夹式DNA探针，加入Hg
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之后，Hg
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会与DNA探针上的T碱基生成T
‑
Hg
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‑
T的稳定结构，使探针结构发生变化，通过改变荧光能量共振转移的距离来实现Hg
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定量检测，但存在以下不足：（1）该法设计的发卡式DNA探针其双链部分本身就有很好的稳定性，检测过程中需要Hg
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竞争结合探针上的T从而改变原有探针的发卡结构，通过形成新的结构实现Hg
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检测，从专业角度出发，该步骤需要复杂的实验条件，难以达到理想的实验效果，影响因素较多，根据其公开的内容不难发现其检测限及线性范围较低。
[0004]同时，以SYBR Green
ꢀⅠꢀ
为代表的核酸染料作为荧光分子探针因具有价格低廉、光稳定性较好、安全等优良的荧光性能，近年来被广泛应用于Hg
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、Pb
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、Cu
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、Ag
+
等离子的检测，但存在SYBR Green
ꢀⅠꢀ
斯托克斯位移小，背景干扰高，影响检测灵敏度。
[0005]因此，针对上述问题，开发一种基于核酸染料的汞离子高灵敏荧光检测探针，是本领域技术人员亟需解决的一项技术问题，具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针及检测方法，实现水溶液中的Hg
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高灵敏度和高选择性地检测，有望用于商
业化的推广应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案。
[0008]一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针，包括Hg
2+
特异识别探针TRO（Thymidine Rich Oligonucleotide）和荧光指示探针Gelred；所述Hg
2+
特异识别探针TRO由25个碱基组成，其中引入了五个T
‑
T错配碱基对和三个自互补碱基对，其核酸序列为：5
’‑
TTTCTTTCCGGGGGGGCGTTTGTTA
ꢀ‑3’
；当存在Hg
2+
时，T
‑
Hg
2+
‑
T错配能诱导TRO折叠形成具有稳定发卡结构的TRO
‑
Hg
2+
复合物；所述荧光指示探针为高灵敏核酸荧光染料Gelred，其在游离状态下发出微弱的荧光，一旦与TRO
‑
Hg
2+
复合物结合后，Gelred荧光强度显著增强，荧光信号强度与TRO
‑
Hg
2+
复合物的数量相关；通过建立荧光强度与Hg
2+
浓度之间对应的线性关系，实现对汞离子的定量检测。
[0009]一种使用基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，包括以下步骤：1）将TRO与Hg
2+
在Tris缓冲液中反应，形成TRO
‑
Hg
2+
复合物；所述TRO浓度为0.01~5μmol/L；Hg
2+
浓度为0.1nmol/L~5μmol/L；Tris缓冲液浓度为0.01~0.1mol/L，其中含20~100mmol/L NaNO3，pH值为6.4~8.6；TRO与Hg
2+
的反应时间为3~15min；2）将Gelred加入上述TRO
‑
Hg
2+
复合物中，室温下避光孵育，使用荧光分光光度计以290nm的激发波长进行荧光光谱测定，并获得Hg
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浓度
‑
荧光强度值标准曲线；所述Gelred为0.01~2
×
Gelred溶液；孵育时间时间为2～15分钟。
[0010]进一步的：步骤1）中：所述TRO浓度为0.05~2μmol/L；Hg
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浓度为5nmol/L~2μmol/L；Tris缓冲液浓度为0.02~0.05mol/L，其中含30~50mmol/L NaNO3，pH值为7.0~7.6；TRO与Hg
2+
的反应时间为为5~8min；步骤2）中：所述Gelred为0.05~1
×
Gelred溶液，孵育时间为5～10min。
[0011]Hg
2+
浓度与荧光强度变化F/F0呈线性关系，且线性方程为y=
‑
0.0004468x+0.8815，R2=0.99103。对水体中Hg
2+
检测线性范围为10nmol/L～800nmol/L，检出限为0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针，其特征在于，包括Hg
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特异识别探针TRO（Thymidine Rich Oligonucleotide）和荧光指示探针Gelred；所述Hg
2+
特异识别探针TRO由25个碱基组成，其中引入了五个T
‑
T错配碱基对和三个自互补碱基对，其核酸序列为：5
’‑
TTTCTTTCCGGGGGGGCGTTTGTTA
ꢀ‑3’
；当存在Hg
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时，T
‑
Hg
2+
‑
T错配能诱导TRO折叠形成具有稳定发卡结构的TRO
‑
Hg
2+
复合物；所述荧光指示探针为高灵敏核酸荧光染料Gelred，其在游离状态下发出微弱的荧光，一旦与TRO
‑
Hg
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复合物结合后，Gelred荧光强度显著增强，荧光信号强度与TRO
‑
Hg
2+
复合物的数量相关；通过建立荧光强度与Hg
2+
浓度之间对应的线性关系，实现对汞离子的定量检测。2.一种使用权利要求1所述的基于功能核酸的检测水体中汞离子的荧光探针的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将TRO与Hg
2+
在Tris缓冲液中反应，形成TRO
‑
Hg
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复合物；所述TRO浓度为0.01~5μmol/L；Hg
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浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：马莉萍，李云霞，马生龙，聂莹莹，宋玉哲，
申请(专利权)人：甘肃省科学院传感技术研究所，
类型：发明
国别省市：