【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌mrna提取，更具体地说是涉及一种磁珠法提取真菌mrna的试剂盒及应用。
技术介绍
1、mrna(信使核糖核酸)作为蛋白质生物合成的直接模板，研究热度一直较高；mrna只占细胞总rna的2％～5％，具有代谢活跃，半衰期短，容易分解等特点，使得mrna的提取以及保存难度很大；因此，mrna研究的前期提取工作显得尤为重要。
2、真菌mrna的提取方法有很多，但这些方法都需要先提取总rna，然后进一步纯化得到mrna，以其中的mrna作为模板，使其反转录成cdna进行pcr扩增来达到基因表达水平的检测，在临床诊断中具有重要意义。然而mrna仅占总rna的1％～5％，加之总rna中成分复杂、干扰因素多，导致扩增效率降低，降低了pcr、rt-pcr的检测灵敏度，难以满足微量核酸样品的分析。因此，高质量mrna的获取是下游实验过程成功进行的关键；这就需要对常规方法进行改进，期望获得高质量高浓度的真菌mrna。
3、因此，如何提供一种以磁珠法提取真菌mrna的试剂盒，并将其应用于真菌mrna的提取中是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术结合纳米磁珠与核酸探针的特点，通过破壁酶液对真菌进行破壁，再利用裂解液对破壁细胞进行裂解，最后用制备的生物素核酸探针跟真菌mrna polya特异性结合，快速获得真菌mrna；缩短了提取步骤，能降低mrna在提取过程中发生的降解问题，具有快捷、特异性强、缩短提取步骤等优点，可为后续实验提供
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种磁珠法提取真菌mrna的试剂盒，包括：破壁酶液、溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f；
4、所述破壁酶液按照体积比包括蜗牛酶70％和溶菌酶30％；
5、所述溶液a由ph＝7.5、浓度为182mg/ml的山梨醇缓冲液和0.1mpbs缓冲液组成；所述溶液b包含1.5m异硫氰酸胍、1m柠檬酸钠溶液、2％sds、1.5m醋酸钠溶液、15％苯酚和0.2％巯基乙醇；
6、所述溶液c为异丙醇；
7、所述溶液d包括链霉亲和素、生物素化核酸探针和羧基磁珠30mg/ml；生物素化核酸探针为oligo(dt)5'端连接生物素，序列为biotin-tttttttttttttttttttt；
8、所述溶液e为乙醇溶液；
9、所述溶液f为te buffer。
10、作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的提取真菌mrna的试剂盒在提取真菌mrna中的应用。
11、作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种磁珠法提取真菌mrna的方法，包括以下步骤：
12、(1)取菌液1.5ml，4℃5000rpm离心2min取沉淀。加入500μl溶液a，加入1ml破壁酶液，充分混匀5～10min，5000rpm离心5min弃上清收集沉淀；
13、(2)向步骤(1)所得沉淀加入1ml溶液b，激烈振荡30s，室温静置10min；12000rpm离心10min；吸取上清转移至另一离心管中；
14、(3)向上清中加入300μl溶液c，20μl溶液d，上下颠倒离心管充分混匀后，静置5min，磁分离；
15、(4)缓慢沿管壁加入1ml溶液e清洗沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，磁分离，此步骤重复2次；
16、(5)弃去溶液e，室温干燥沉淀5～10min，加入40μl溶液f洗脱，磁分离取上清冷冻保存；
17、(6)反转录，取出产物-20℃保存。
18、优选地，反转录体系如下：
19、
20、反转录程序为45℃24min、94℃5min、94℃30s、61℃30s，72℃1kbp/min，35个循环；72℃延伸10min。
21、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术用破壁酶在山梨醇缓冲液下充分破解真菌，再由连接了生物素核酸探针的链霉亲和素磁珠悬浮液特异性结合真菌mrna。该试剂盒可以快速、特异的提取真菌mrna，防止真菌mrna在提取过程中降解，获得高质量真菌mrna，具体效果为：
22、(1)本专利技术利用改进的酶法破壁代替传统的液氮法机械破壁，通过制备的生物素化核酸探针和链霉亲和素连接的羧基磁珠相结合的提取方法，裂解真菌细胞壁时只需加入破壁酶液无需加液氮冷冻研磨，简化了操作方法，降低了真菌mrna在提取过程中的损耗；
23、(2)本专利技术能直接提取纯化真菌mrna，相比于传统提取方法先提取真菌总rna后二次纯化得到mrna，缩短了提取步骤，大大提高了真菌mrna提取效率和质量；
24、(3)本试剂盒提取的mrna纯度较高，蛋白质和盐类含量少。该提取方法基于生物素化核酸探针-链霉亲和素磁珠特异性结合mrna，通过磁吸附弃去杂质，避免蛋白质、盐类吸附到磁珠，od260/280能达到1.90-2.00；
25、(4)基于改进的酶法破壁和制备的特异性生物素化核酸探针-链霉亲和素磁珠核酸富集技术建立了一种真菌mrna提取的新方法，该方法快速、简便、特异性强，可用于实际样品中真菌mrna提取以及复杂样品中真菌mrna提取；
26、(5)本专利技术有利于推进真菌mrna提取自动化的实现；
27、(6)试剂盒操作简单，省去很多离心等中间步骤，能高效特异性提取真菌mrna；
28、(7)本试剂盒很大限度减少了有机溶剂的使用，降低了对人体和环境的危害；试剂盒包括一种专有的酶混合物，可以裂解较难破壁的真菌。
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1.一种磁珠法提取真菌mRNA的试剂盒，其特征在于，包括：破壁酶液、溶液A、溶液B、溶液C、溶液D、溶液E、溶液F；
2.权利要求1所述的提取真菌mRNA的试剂盒在提取真菌mRNA中的应用。
3.一种磁珠法提取真菌mRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种磁珠法提取真菌mRNA的方法，其特征在于，反转录体系如下：
【技术特征摘要】
1.一种磁珠法提取真菌mrna的试剂盒，其特征在于，包括：破壁酶液、溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f；
2.权利要求1所述的提取真菌mrna的试剂盒在提取真菌mrn...
【专利技术属性】
技术研发人员：马生龙，聂莹莹，马莉萍，李云霞，
申请(专利权)人：甘肃省科学院传感技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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