一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，所述方法包括烟草基因组DNA提取方法、引物的设计、LAMP反应体系建立、LAMP反应体系的优化。本发明专利技术根据筛选的烟草特异性基因Ntsp151序列保守区设计LAMP引物，建立了基于颜色判定的LAMP方法，能够快速地对烤后烟叶、成品卷烟及茶烟等进行鉴别，检测限达到200copies/反应；对非烟样本检测结果均为阴性，具有较好的特异性；与qPCR检测结果符合率为96.7％，但LAMP方法在1h左右即可观察结果，快速简便，对于临检的快速结果判断有重要的意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法


[0001]本专利技术属于分子生物学鉴定检测方法
，尤其是涉及一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法


技术介绍

[0002]烟草是一种重要的经济作物，是制备商品化卷烟的主要原料。在市场经济的调节下，烟草行业的重要性日益显现，也从单纯的高速增长逐渐演变成高质量的发展，因此对烟草的“真”“假”鉴别仍是烟草检验中面临的一个重要挑战。烟草的“真”“假”鉴别主要是利用分子生物学的方法，例如特征序列扩增区域标记(SCAR)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列检测(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)等，这些技术往往需要PCR仪、基因测序仪等复杂的设备，在一定程度上限制了在专卖执法一线临检中的应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术正是为了解决上述问题缺陷，提供一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法。
[0004]本专利技术采用如下技术方案实现。
[0005]一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，本专利技术所述方法包括烟草基因组DNA提取方法、引物的设计、LAMP反应体系建立、LAMP反应体系的优化。
[0006]进一步为，本专利技术所述烟草基因组DNA提取方法包括：称取10～15mg烟草样本加入到EP管中，加入5％ Chelex
‑
100悬浊液，用研磨棒研磨1～2min，震荡混悬10～30s；加入1/10体积的蛋白酶K和1/10体积的RnaseA，震荡混悬10～30s，55℃水浴作用5min；100℃煮沸5min；震荡混悬10～30s，12000r/min离心2min，取上清，待检。
[0007]进一步为，本专利技术所述引物的设计包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LB；
[0008]F3：5'
‑
TTGGCTATGGAATTTATCACAT
‑
3'；
[0009]B3：5'
‑
AGCCGCTTTCAAAATCCG
‑
3'；
[0010]FIP：5'
‑
ACCCGAGCCATCCTCTTCTTCTATATTCCTTTTTCTTGGCACATT
‑
3'；
[0011]BIP：5'
‑
TACGACTACGCCTCGCTGTTAGGCTCAATTTTCCCCACT
‑
3'；
[0012]LB：5'
‑
GCTTAGGCATGTTTGAGCCAATT
‑
3'。
[0013]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系建立包括：以合成的pcDNA3.1
‑
Ntsp151重组质粒为模板，建立基于颜色判定的LAMP检测体系；反应体系如下：1
×
Bst2.0 DNA polymerase buffer、6mmol/L MgSO4、0.5mmol/LdNTP、0.1μmol/L F3和0.1μmol/L B3、8μmol/L FIP和8μmol/L BIP、0.2μmol/L LB、8UBst2.0 DNA聚合酶、2.0μL模板，并补加ddH2O至总体积为25μL，反应结束后将LAMP扩增产物与含有SYBR GreenI的显色盖混合，通过观察反应液的颜色对结果进行判断；
[0014]显色盖的制备：将SYBR Green I染料进行104稀释，加入到与八联排PCR管配套的
管盖中，37℃烘干4h，室温避光保存；
[0015]将LAMP的反应产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察梯形条带。
[0016]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系的优化包括LAMP反应的温度为60～65℃。
[0017]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系的优化包括LAMP反应的温度为63℃。
[0018]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系的优化包括LAMP反应的Mg
2+
浓度为0
‑
12mmol/L。
[0019]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系的优化包括LAMP反应的最适Mg
2+
浓度为6mmol/L。
[0020]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系优化包括LAMP反应时间为15
‑
90min。
[0021]进一步为，本专利技术所述LAMP反应体系优化包括LAMP反应时间为60min。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023]1)本专利技术开发了一种快速的烟草基因组DNA提取方法，整个提取过程可以控制在20min，快速简便。该快速提取方法与普通的虑柱提取的DNA用于LAMP检测时，二者之间无明显的差异。
[0024]2)本专利技术利用SYBR GreenI建立的烟草快速检测LAMP技术，可以在20min内完成样本的前处理和基因组DNA的提取，将LAMP扩增反应控制在45min，对Ntsp151基因的检测灵敏度可以达到200copies/反应，通过肉眼或紫外灯照射快速对结果进行判断。
[0025]3)本专利技术根据筛选的烟草特异性基因Ntsp151序列保守区设计LAMP引物，建立了基于颜色判定的LAMP方法，能够快速地对烤后烟叶、成品卷烟及茶烟等进行鉴别，检测限达到200copies/反应；对非烟样本检测结果均为阴性，具有较好的特异性；与qPCR检测结果符合率为96.7％，但LAMP方法在1h左右即可观察结果，快速简便，对于临检的快速结果判断有重要的意义。
[0026]下面结合附图和具体实施方式本专利技术做进一步解释。
附图说明
[0027]图1为本专利技术LAMP扩增体系的建立实验图。图注：PC，阳性对照；NC，阴性对照；M，DNA Ladder。
[0028]图2为本专利技术LAMP最佳Mg
2+
浓度的确定实验图。图注：M，DNA Ladder；0、2、4、6、8、10、12表示体系中添加的Mg
2+
浓度；NC，阴性对照。
[0029]图3为本专利技术LAMP最佳反应温度的确定实验图。图注：M，DNA Ladder；60、61、62、63、64、65表示不同的反应温度；NC，阴性对照。
[0030]图4为本专利技术反应时间对LAMP扩增的影响实验图。图注：M，DNA Ladder；15、30、45、60、75、90表示不同的反应时间；NC，阴性对照。
[0031]图5为本专利技术LAMP特异性实验图。图注：N，阴性对照；P，阳性对照；Nt01，基因组DNA；1
‑
17分别为花生、豌豆、蚕豆、玉米、小麦、大麦、水稻、辣椒、茄子、马铃薯、番茄、矮牵牛、曼陀罗、枸杞、油菜、绿茶、普洱茶。
[0032]图6为本专利技术LAMP灵敏度实验图。图注：M，DNA Ladder；NC，阴性对照；106、105、104、103本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，其特征在于，所述方法包括烟草基因组DNA提取方法、引物的设计、LAMP反应体系建立、LAMP反应体系的优化。2.根据权利要求1所述的一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，其特征在于，所述烟草基因组DNA提取方法包括：称取10～15mg烟草样本加入到EP管中，加入5％Chelex
‑
100悬浊液，用研磨棒研磨1～2min，震荡混悬10～30s；加入1/10体积的蛋白酶K和1/10体积的RnaseA，震荡混悬10～30s，55℃水浴作用5min；100℃煮沸5min；震荡混悬10～30s，12000r/min离心2min，取上清，待检。3.根据权利要求1所述的一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，其特征在于，所述引物的设计包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LB；F3：5'
‑
TTGGCTATGGAATTTATCACAT
‑
3'；B3：5'
‑
AGCCGCTTTCAAAATCCG
‑
3'；FIP：5'
‑
ACCCGAGCCATCCTCTTCTTCTATATTCCTTTTTCTTGGCACATT
‑
3'；BIP：5'
‑
TACGACTACGCCTCGCTGTTAGGCTCAATTTTCCCCACT
‑
3'；LB：5'
‑
GCTTAGGCATGTTTGAGCCAATT
‑
3'。4.根据权利要求1所述的一种适用于烟草快速检测的可视化LAMP方法，其特征在于，所述LAMP反应体系建立包括：以合成的pcDNA3.1
‑
Ntsp151重组质粒为模板，建立基于颜色判定的LAMP检测体系；反...

【专利技术属性】
技术研发人员：张轲，童治军，杨金初，秦世春，陈丹，王春琼，孙浩巍，张晓伟，孙九喆，龙杰，李萌，蔡洁云，张冀武，盖小雷，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：