非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用。其非洲猪瘟病毒嵌合重组表达的蛋白为包含了在非洲猪瘟病毒感染和病毒壳形成中起主要作用的p30、p72和p54的部分片段，每个片段经过表位分析软件选取抗原表位比较集中的基因片段。本发明专利技术提供的重组蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒三个结构蛋白p30、p72和p54的主要抗原表位部分序列，旨在弥补单一表达蛋白作为抗原制备亚单位疫苗时保护力不足，以及作为诊断试剂抗原对病毒感染整个过程的灵敏度和特异性均不理想等缺点。本发明专利技术所选择的p30、p54和p72蛋白贯穿非洲猪瘟病毒感染的整个过程，在非洲猪瘟病的诊断和预防领域具有广阔的市场应用价值。诊断和预防领域具有广阔的市场应用价值。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于农业生物
，具体涉及非洲猪瘟病毒(ASFV)p30、p72和p54嵌合重组蛋白、其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的猪的高度接触性传染病。其临床症状主要以发热、呼吸和神经系统功能紊乱、内脏器官病变、广泛性出血为主。病程短，发病率和死亡率均很高，家猪感染后十天内死亡率接近100％。目前还没有有效的商品化疫苗和药物能够预防和治疗该病，一经发现只能大规模扑杀，对生猪养殖业和猪肉贸易领域造成严重经济损失。因此筛选出具有良好免疫原性和抗原性的ASFV结构蛋白对于ASF的预防、治疗和研发高灵敏性和特异性检测试剂盒具有重大意义。
[0003]ASFV是一种正20面体，是在感染细胞的细胞质内复制的病毒。ASFV编码的蛋白超过200个，其中有50多种结构蛋白。有研究报道ASFV的50多种蛋白包装成病毒粒，并在病毒感染中发挥作用。ASFV的病毒粒是一种复杂的多层结构组成，直径大小170～190nm(Salas et al.,Virus Res 2013,173,29
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41.)。ASFV编码的结构蛋白参与基因组复制和病毒感染(Dixon et al.，Virus Res 2013，173，3
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14.)。p54和p30是参与ASFV入侵过程的结构蛋白。p54由E183L基因编码的，相对分子量大小为25KDa，是ASFV重要抗原结构蛋白。p54蛋白位于病毒粒外模脂质上在宿主细胞内质网膜聚集和转化为病毒囊膜前体过程中起到关键作用(Rodr
í
guez et al.，J Virol 2004，78，4299
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4313.)，并在病毒生长和在弱毒株免疫猪体内诱导产生特异性抗体过程中发挥重要作用(Rodriguez et al.，.Virus Res 1996，40，161
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167.)。p54抗体能够抑制ASFV感染周期第一步，病毒附着。除此之外p54蛋白能够诱导受感染细胞产生细胞凋亡(G
ó
mez
‑
Puertas et al.，Virus Res1997，49，115
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122.)。p30与p54一样也是早期病毒蛋白，由CP204L基因编码，相对分子量大小为30kDa，主要的抗原结构蛋白之一，参与ASFV入侵细胞过程。(S
á
nchez et al.，Virus Res 2013，173，58
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75.)。ASFV入侵细胞后2～4小时就开始表达p30蛋白质并贯穿病毒感染整个周期。因此，p30蛋白质的表达标志着病毒入侵和早期病毒基因表达开始。(Lithgow et al.，Vet Microbiol 2014，168，413
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419.)。p72由B646L(VP72)基因编码的重要抗原蛋白，分子量大小为73.2KDa，是ASFV主要结构蛋白之一。p72具有很高的抗原性和免疫原性，是ASFV 20面体主要组成部分。P72位于病毒衣壳表面，在病毒感染后期表达中形成核衣壳过程中起关键作用(Neilan et al.，Virology 2004，319，337
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342.)。
[0004]鉴于以上所述特点本专利技术创新点在于将三个主要结构蛋白嵌合在一起一次性重组表达，获得含有三种蛋白的重组表达抗原，由于p72、p30和p54三种抗原贯穿于非洲猪瘟病毒入侵到后期表达整个感染过程，因此在非洲猪瘟病的诊断和预防方面有广泛的应用前景。但是现在市面上尚未发现以非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三个蛋白嵌合表达重组蛋白作
为抗原的诊断试剂盒和疫苗，因采用现有技术同时表达三种蛋白较困难。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白、其制备方法与应用，该重组表达蛋白串联嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白。本专利技术对非洲猪瘟病毒主要结构蛋白保护性抗原蛋白进行了克隆表达，构建了表达较高的重组蛋白的表达菌株。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0007]一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，该嵌合重组表达蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白片段的蛋白质(命名为p307254)，其中，p30的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，p72的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，p54的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0008]如上所述的非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，优选地，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列相同免疫原性和中和活性的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。
[0009]编码如上所述的重组表达蛋白的基因，其含有SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
[0010]编码如上所述的重组表达蛋白的基因，该基因的核苷酸序列为如下序列之一：
[0011]1)如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
[0012]2)与SEQ ID NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
[0013]其中，SEQ ID NO.2所示序列编码非洲猪瘟病毒p30、p72和p54蛋白嵌合基因序列(p307254基因)由1182个核苷酸组成，其中自5
’
到3
’
端第1位到366位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p30核苷酸序列，第367位到786位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p72核苷酸序列，第787位到第1182位碱基为非洲猪瘟病毒结构蛋白p54核苷酸序列。
[0014]一种表达载体，其含有如SEQ ID NO.2所示基因序列。
[0015]一种细胞系，其含有如SEQ ID NO.2所示基因序列。
[0016]一种非洲猪瘟病毒嵌合重组P30、p72和p54蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
[0017]扩增如SEQ ID NO.2所示的目的片段；
[0018]将目的片段与表达载体相连转入大肠杆菌；
[0019]筛选阳性克隆；
[0020]诱导表达得到目的蛋白。
[0021]如上所述的制备方法，优选地，扩增目的片段的方法为：
[0022]首先用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14以及SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p30、p72和p54嵌合重组表达蛋白，其特征在于，该蛋白为嵌合表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p54的结构蛋白片段的蛋白质；其中，p30的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，p72的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，p54的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.如权利要求1所述的重组表达蛋白，其特征在于，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或是与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。3.编码如权利要求1所述的重组表达蛋白的基因，其特征在于，其能嵌合重组p30、p72和p54蛋白的基因，其含有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。4.编码如权利要求1所述的重组表达蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为如下序列之一：1)如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；2)与SEQ ID NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。5.一种表达载体，其含有如SEQ ID NO.2所示序列。6.一种细胞系，其含有如SEQ ID NO.2所示序列。7.一种嵌合重组表达非洲猪瘟病毒p30、p72和p...

【专利技术属性】
技术研发人员：何润春，何诚，
申请(专利权)人：北京普飞特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：