一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母及其构建方法；所述的重组酿酒酵母过表达Cna1基因。所述Cna1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述的酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c。本发明专利技术通过过表达Cna1基因，促进了重组菌株生物膜的形成，同时本发明专利技术第一次将真菌信号通路基因利用到基于生物膜固定化发酵生产乙醇当中，提高了重组菌株的生物膜量。物膜量。物膜量。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物技术
，具体涉及一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]生物膜，又称生物被膜，是自然界当中微生物之间相互合作自发形成的多细胞群体，由微生物细胞分泌出来的胞外聚合物(EPS)组成。在微生物的生命活动中，生物膜起着非常重要的作用，不仅可以为其提供一个稳定的内环境，以此抵抗外界恶劣的环境，还可以提高反应底物以及产物的耐受性，使发酵产量得到提升，这在生物膜工业化应用中有一定的发展前景。与此同时，生物膜还承担着细胞间以及细胞与介质间的运输、信息传递等功能，因此提高生物膜稳定性对于微生物的生长具有重要的意义。
[0003]在微生物生物膜的形成过程中，会受到细胞内各种信号通路的调控。在不同的环境作用下，这些信号通路相互协调以此来调控生物膜的形成。在真菌中，有关信号通路对生物膜形成的影响的报道中，有钙调磷酸酶信号通路对生物膜的影响，但是在酿酒酵母中相关报道少之又少。
[0004]传统的酿酒酵母细胞固定化发酵如Ghasem Najafpour等利用海藻酸钠凝胶来固定酿酒酵母细胞，使发酵周期缩短至7小时，较游离发酵乙醇产率提高8％。然而在发酵过程中，营养物质会扩散到凝胶中，细胞也会排放乙醇和CO2，且凝胶珠本身的稳定性差，容易破损，导致无法长期高效地实现连续发酵，因此不适合应用于工业上固定化发酵生产乙醇。生物膜固定化发酵是一种基于微生物群集群效应的发酵模式，与传统的吸附法有着明显的不同。在生物膜固定化发酵过程中，游离细胞逐渐吸附到载体表面，形成微生物集群效应，生物膜密度获得提高，同时提升了整体的代谢活力和对环境的抵抗能力。因此，本专利技术通过构建一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母，促进重组菌株生物膜的形成，提以此来提高生物膜固定化发酵生产乙醇当中重组菌株的生物膜量。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组酿酒酵母的构建方法。
[0007]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组酿酒酵母的应用。
[0008]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母。
[0009]其中，所述Cna1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]其中，所述的酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC1308。
[0011]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母的构建方法，包
括如下步骤：
[0012](1)以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c基因组作为模板，对目的基因Cna1进行PCR扩增得到Cna1基因片段；
[0013](2)将步骤(1)中得到的Cna1基因片段与纯化后线性质粒pYX212相连接，得到重组质粒pYX212
‑
Cna1；
[0014](3)将步骤(2)中得到的重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，提取筛选重组质粒pYX212
‑
Cna1，并测序验证。
[0015](4)将步骤(3)提取得到的重组质粒转入到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c感受态中，构建过表达Cna1基因的重组酿酒酵母菌株S288c
‑
pCna1。
[0016]步骤(1)中，所述的PCR扩增所用引物为Cna1
‑
F和Cna1
‑
R，其引物序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
[0017]步骤(2)中，所述的线性质粒pYX212为经BamHⅠ酶对质粒pYX212进行单酶切后的载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0018]为了解决上述第三个技术问题，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母在促进生物膜形成中的应用。
[0019]进一步地，本专利技术公开了上述重组酿酒酵母在发酵生产乙醇中的应用。
[0020]其中，所述的发酵为分离发酵或固定化发酵，优选的为固定化发酵。
[0021]其中，所述的发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
[0022]其中，所述的发酵包括如下步骤：
[0023](a)各取10μL甘油菌S288c(原始菌)和S288c
‑
pCna1加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养，活化；
[0024](b)按照体积比1％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8～1.2之间；
[0025](c)将步骤(b)的种子液按10％的接种体积比例转接至100mL的发酵培养基中，分为游离发酵与固定化发酵两种。
[0026]进行固定化发酵时：向发酵培养基中加入棉纤维材料作为固定化材料，每个摇瓶中加入4g棉纤维介质；于30℃、200r/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用测糖仪测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量。
[0027]进行分离发酵时：除了不添加固定化材料，其余与固定化发酵相同。
[0028]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
[0029]1、本专利技术构建了一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母，对重组菌株生物膜的形成有促进作用，提高了重组菌株的生物膜量。
[0030]2、本专利技术是第一次将真菌信号通路基因利用到基于生物膜固定化发酵生产乙醇当中。
[0031]3、本专利技术所构建的重组酿酒酵母经过生物膜固定化发酵，具有缩短发酵周期，提升乙醇发酵产量，提高发酵效率等优点，在工业生产中有着良好的应用前景和价值。
附图说明
[0032]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做更进一步的具体说明，本专利技术的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0033]图1为构建重组的表达质粒pYX212
‑
Cna1质粒示意图。
[0034]图2为Cna1基因扩增的电泳结果。
[0035]图3为载体线性化电泳结果。
[0036]图4为重组质粒构建的电泳结果。
[0037]图5为重组菌菌落PCR的验证。
[0038]图6为菌株生长能力实验结果(上为重组菌，下为原始菌)。
[0039]图7为平板入侵实验结果(左为原始菌，右为重组菌)。
[0040]图8为96孔板结晶紫染色实验结果(左为原始菌，右为重组菌)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株过表达Cna1基因的重组酿酒酵母，其特征在于，所述的重组酿酒酵母过表达Cna1基因。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述Cna1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述的酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c。4.权利要求1～3中任意一项所述的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c基因组作为模板，对目的基因Cna1进行PCR扩增得到Cna1基因片段；(2)将步骤(1)中得到的Cna1基因片段与纯化后线性质粒pYX212相连接，得到重组质粒pYX212
‑
Cna1；(3)将步骤(2)中得到的重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，提取筛选重组质粒pYX212
‑
Cna1，并测序验证；(4)将步骤(3)提取得到的重组质粒转入到酿酒酵母Saccharomyces cere...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，李国雄，应汉杰，孙文俊，陈天鹏，余斌，石书琪，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：