针对O型口蹄疫病毒的免疫血清抗体的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种针对O型口蹄疫病毒的免疫血清抗体的单克隆抗体及其应用，涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。本发明专利技术使用vp1蛋白做为免疫原，分别使用含B细胞抗原表位的多肽与灭活抗原做为筛选原，筛选出能与O型口蹄疫病毒灭活疫苗和合成肽疫苗免疫背景血清均有竞争作用的单克隆抗体，并建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA试剂盒，大幅缩短了检测时间，提高了试剂盒敏感性、特异性以及稳定性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
针对O型口蹄疫病毒的免疫血清抗体的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及动物病毒学与动物传染病学检测
，特别涉及针对O型口蹄疫病毒的免疫血清抗体的单克隆抗体。

技术介绍

[0002]口蹄疫(Foot And Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot And Mouth Disease Virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物(猪、牛、羊、骆驼等)共患的急性、热性、接触性传染病，该病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首，对畜牧业生产的危害极大，消灭和控制口蹄疫是各国政府共同关注的世界性问题。我国对口蹄疫的控制和扑灭，主要措施是强制免疫。目前，广泛使用的口蹄疫疫苗以灭活苗和合成肽疫苗使用得最多。口蹄疫疫苗免疫主要诱导中和抗体的产生，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件。
[0003]血清学检测是对血清中的特异性抗体进行定性或定量鉴定，在口蹄疫诊断检疫及动物群体口蹄疫疫苗效力评价中应用最为广泛。病毒中和试验是最为经典的口蹄疫血清学诊断方法，但是该试验存在动用活毒，操作时间长，试验结果难重复的缺点。从1986年发展起来的液相阻断ELISA(LPB)由于其快速、重复性好、不动用活毒，成为了病毒中和试验的替代方法，但其也存在假阳性率高，不能检测多肽疫苗免疫背景的血清抗体等缺点。固相竞争ELISA方法(SPC)除了具有液相阻断ELISA方法(LPB)的优点外，其特异性更好，操作更为简便，结果更稳定，容易重复，2004年被世界动物卫生组织(OIE)确立为国际贸易中口蹄疫血清学检测指定方法之一。
[0004]口蹄疫病毒易变异，现已确定有7个病毒血清型，O、A、C型(即欧洲型)，SAT1、SAT2、SAT3(南非1，2，3型，即非洲型)和AsiaⅠ(亚洲Ⅰ型)。这7个病毒血清型间无交叉反应，各血清型又包括不同的变异型。FMDV的抗原位点研究表明，结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4均参与抗原位点的构成。O型口蹄疫病毒的抗原位点主要位于结构蛋白VP1上，VP1是诱导动物产生中和抗体的主要成分，其中141～160、200～213位氨基酸肽段能够保护动物抵抗病毒攻击，是重要的B细胞抗原表位，也是O型口蹄疫病毒疫苗免疫和诊断方法建立重要的靶标。
[0005]现有技术中，例如CN114921418A提供了一株O型口蹄疫类病毒颗粒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D3及试剂盒和检测方法，该方法能检测出O型口蹄疫类病毒颗粒疫苗免疫血清抗体，用于区分O型口蹄疫野毒、全病毒灭活疫苗和类病毒颗粒疫苗免疫血清。又例如CN106405092A提供的一种基于型特异性单抗的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA试剂盒，试剂盒中含有HRP标记的O型口蹄疫特异性单抗。又例如CN109799342A提供的一种O型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，使用由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成的O型口蹄疫病毒样颗粒免疫兔子，分离获得的竞争性抗体用HRP直接标记。然而，上述现有技术均采用的是常规的单克隆抗体筛选方法，没有提供目前市售各类口蹄疫O型疫苗免疫血清的检测效果，无法对现售疫苗的免疫效果进行评价。

技术实现思路

[0006]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了针对O型口蹄疫病毒的免疫血清抗体的单克隆抗体，还提供了相应的固相竞争ELISA试剂盒；使用vp1蛋白做为免疫原，分别使用含B细胞抗原表位的多肽与灭活抗原做为筛选原，筛选出能与O型口蹄疫病毒灭活疫苗和合成肽疫苗免疫背景血清均有竞争作用的单克隆抗体，建立O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA试剂盒，其检测位点是针对目前市售的灭活疫苗和合成肽疫苗都有竞争效果的，提高了试剂盒敏感性、特异性以及稳定性；能对口蹄疫O型疫苗的免疫效果进行准确评价，对养殖场O型口蹄疫防控具有生产指导意义，同时操作简单，大幅缩短了检测时间，节约了成本。具体通过以下技术实现。
[0007]针对O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗和灭活苗免疫血清抗体的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
3所示；所述轻链的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4
‑
6所示。
[0008]优选地，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0009]本专利技术还提供了上述的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1、根据O型口蹄疫病毒的vp1蛋白的基因序列，构建vp1蛋白的重组表达质粒，通过表达、纯化获得vp1蛋白；
[0011]同时，将O型口蹄疫病毒的vp1蛋白的第141
‑
160的肽段和200
‑
213位的肽段进行串联，获得合成多肽；
[0012]S2、使用步骤S1所得的vp1蛋白进行动物免疫，制备免疫脾细胞的细胞悬液；
[0013]S3、将步骤S2制备的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，分别使用市售口蹄疫O型灭活抗原，以及步骤S1制备的vp1蛋白和合成多肽包被的板子，进行间接ELISA检测，获得若干待选杂交瘤细胞株；
[0014]S4、将步骤S3所得的若干待选杂交瘤细胞株，分别使用以市售的灭活疫苗免疫的血清和以市售的合成多肽疫苗免疫的血清做竞争ELISA筛选，获得阳性杂交瘤细胞株；
[0015]S5、使用步骤S4制备的阳性杂交瘤细胞株制备获得所述单克隆抗体。
[0016]优选地，上述单克隆抗体的制备方法中，步骤S1的优化后的O型口蹄疫病毒的vp1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.9所示.
[0017]优选地，上述单克隆抗体的制备方法中，步骤S3的进行间接ELISA检测后，P/N≥2.1的细胞即为待选杂交瘤细胞株。
[0018]优选地，上述单克隆抗体的制备方法中，步骤S4的两种血清的PI值均≥60％的杂交瘤细胞株即为所述阳性杂交瘤细胞株。
[0019]本专利技术还提供了一种针对O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗和灭活苗免疫血清抗体的固相竞争ELISA检测试剂盒，包括HRP标记的权利要求1所述的单克隆抗体。
[0020]优选地，上述固相竞争ELISA检测试剂盒还包括酶标板、样品稀释液(例如磷酸盐缓冲液)、样品洗涤液(例如含有磷酸盐缓冲液和吐温的洗涤液)、显色液(单组分TMB)和终止液(2M稀硫酸)，所述酶标板上包被了O型口蹄疫病毒vp1蛋白的。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益之处在于：
[0022]1、本专利技术的单克隆抗体和相应的固相竞争ELISA检测试剂盒适用于O型口蹄疫病毒灭活疫苗和合成肽疫苗免疫的血清的检测。与经典方法兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测灭活疫苗免疫背景血清符合率高；检测合成肽疫苗免疫背景血清敏感性较好，且合成肽疫苗一免28天可以检测到血本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.针对O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗和灭活苗免疫血清抗体的单克隆抗体，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1
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3所示；所述轻链的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4
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6所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、根据O型口蹄疫病毒的vp1蛋白的基因序列，构建vp1蛋白的重组表达质粒，通过表达、纯化获得vp1蛋白；同时，将O型口蹄疫病毒的vp1蛋白的第141
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160的肽段和200
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213位的肽段进行串联，获得合成多肽；S2、使用步骤S1所得的vp1蛋白进行动物免疫，制备免疫脾细胞的细胞悬液；S3、将步骤S2制备的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，分别使用市售口蹄疫O型灭活抗原，以及步骤S1制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：马磊，雷宇平，孙圣福，但汉并，周云朵，柯文婷，董晓辉，徐高原，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：