一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂技术

本发明专利技术提供了一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂，所述HCV重组蛋白包括截短的NS3蛋白和截短的Core蛋白，可提高机体对于HCV抗原的免疫应答程度，有利于抗KCV疫苗的开发，以及HCV诊断抗体的筛选；优化了HCV重组蛋白制备工艺，包括使用大肠杆菌偏好密码子设计所述重组蛋白核苷酸序列，提高生产能力；优化制备过程中的工艺步骤和操作参数，并提供了具有良好生产性能的发酵培养基，从而获得高纯度的重组蛋白；基于所述HCV重组蛋白，免疫小鼠获得了目标抗原具有高亲和力的单克隆抗体，能够有效识别HCV；利用所述抗体，构建检测试剂盒，能够有效检测HCV感染情况，从而提供了一种兼具高特异性、高灵敏性和良好稳定性的检测手段。定性的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂

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[0001]本专利技术属于疾病诊断领域，具体提供了一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂。

技术介绍
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[0002]慢性丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因之一。尽管可以使用直接作用抗病毒药物(direct
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acting antivirals，DAA)进行有效治疗，DAA可以令人满意地治疗95％以上的HCV感染者，从而降低肝癌和肝硬化的死亡风险，但全世界仍有约7100万人长期感染该病毒，因此面临发展为终末期肝病的风险(World Health Organization.Global Hepatitis Report.World Health Organization；Geneva,Switzerland:2017)。DAA药物过于昂贵，因此大规模治疗存在社会经济障碍，特别是在低收入和中等收入国家，因此仅适用于发展中国家和发达国家的一小部分感染患者。此外，DAA治疗不能预防或阻止癌变的发生，DAA治疗后，HCC复发率甚至可能增加(Sanduzzi
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Zamparelli M.,Boix L.,Leal C.,Reig M.Hepatocellular carcinoma recurrence in HCV patients treated with direct antiviral agents.Viruses.2019；11:406)。并且，再感染在高危人群中仍然存在，使得单纯依靠药物治疗丙型肝炎难以得到令人满意的效果。因此，HCV的诊断不足仍然是一个严峻的挑战，开发有效的新型HCV诊断试剂显得尤为重要。
[0003]HCV感染的常规诊断系统涉及血清学生物标志物和分子检测。血清学生物标志物可检测抗HCV抗体或HCV抗原，而分子检测可检测HCV RNA。目前，使用血清学检测来检测抗HCV抗体是HCV检测算法中的第一步，因为它们比分子检测更易于处理且更经济实惠。
[0004]检测抗HCV抗体的金标准血清学测试是第三代酶免疫测定法(EIA)，即ORTHO HCV 3.0版ELISA测试系统(Ortho Diagnostic Systems，美国)和Murex抗HCV 4.0(Murex Diagnostics，英国)多重检测检测使用不同核心、NS3、NS4和NS5重组抗原的抗HCV抗体。EIA的变体包括化学发光免疫测定(CLIA)，Foresight HCV EIA测试(ACONLabs,US)就是这种情况，酶促CLIA，如鲁米诺
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H2O2‑
辣根过氧化物酶(HRP)和化学发光微粒免疫测定法(CMIA)。其他相关HCV抗体检测技术，包括荧光免疫测定法、抗HCV抗体检测蛋白芯片法等，也都在临床上得到了应用。
[0005]自从HCV被发现以来，研究人员对于HCV的基因组、蛋白质组和代谢组学进行了深入的研究，发现HCV基因组长约9.6kb，编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白(C、E1、E2、P7)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，其中Core、NS3抗原在抗原反应性上有很好的互补性，其联合检出率平均值可在99％左右，是研究HCV诊断试剂的重点区段，以有研究人员提出设计和制备Core
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NS3融合蛋白，用于HCV的检测(CN113640519A)。此外，CN105254724A提出构建截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，用于HCV检测；CN102072957A提出利用微粒子化
学发光免疫分析技术，用特异性的HCV重组多抗原组份(即含盖Core、NS3、NS4、NS5的基因片段)标记磁微粒，特异性抗人IgG标记异鲁米诺，反应体系采用两步法检测HCV。
[0006]虽然现有技术中已经公开了使用HCV Core和NS3抗原构建融合蛋白或相关抗体，进而检测HCV病毒，但是现有方法要么使用全长蛋白，抗原表位不明确；要么靶向单一类型抗原，难以有效提高检测准确性，从而限制了其在丙型肝炎诊断中的应用。因此，本申请提供了一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法，该方法中构建包括HCV截短Core和截短NS3抗原的融合蛋白，并使用该融合蛋白筛选单克隆抗体，用于制备丙型肝炎诊断试剂盒，可提高检测的灵敏度和特异性。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术中提供了一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法，所述HCV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述制备方法包括：构建携带所述HCV重组蛋白基因的表达载体；将所述表达载体导致大肠杆菌表达系统中；高密度发酵培养大肠杆菌；收集大肠杆菌菌体，分离纯化获得可溶性HCV重组蛋白。
[0008]本专利技术中所述提供的可溶性HCV重组蛋白为一种融合蛋白，其包括截短的NS3蛋白和截短的Core蛋白，这两种蛋白在抗原反应上具有很好的互补性，为HCV诊断试剂的重点区段，因而使用同时包括NS3蛋白和Core蛋白区段的融合蛋白可提高检测的准确性和灵敏度，为后续筛选高特异性抗体奠定了良好基础；该融合蛋白除用于免疫小鼠获得检测抗体外，还能够用于潜在的HCV疫苗，在机体内激起有效免疫应答，为开发新型HCV预防药物提供基础。此外，使用截短的蛋白片段构建融合蛋白，可降低分子生物学操作难度，提高机体内吸收效率和生物利用度，有利于调动实验动物的免疫机能，为筛选并获得高特异性抗体提供保障。
[0009]进一步的，所述HCV重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该核苷酸序列根据大肠杆菌偏好密码子所设计，能够提高在大肠杆菌表达体系中的表达效率，有利于重组蛋白的制备和纯化过程。
[0010]进一步的，所述制备方法还包括：通过PCR扩增所述重组蛋白基因，并在其核苷酸序列两端引入Xho I和EcoR I酶切位点，酶切后连接至pET28a载体，电转化入DH5α感受态细胞中；筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定正确克隆；将所述重组蛋白基因连接至原核表达载体pGEX 6P
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1中，将所述原核表达载体导入大肠杆菌BL21，扩大培养后接种于生物反应器中，加入发酵培养基，37℃培养，通气量0.8
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1.5L/L
·
min，搅拌速率350
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450r/min；加入IPTG诱导16小时，离心收集菌体；所述菌体经超声破碎，用Protein A法纯化蛋白，获得所述可溶性HCV重组蛋白。
[0011]进一步的，所述发酵培养基包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸一氢钾2.34g/L，磷酸二氢钾3.58g/L，氯化钠10g/L，七水硫酸镁0.64g/L，六水氯化铁0.56g/L，甘油10g/L，葡萄糖5g/L。
[0012]提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别HCV的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.3
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5所示的CDR
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H1
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3；所述抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.6
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8所示的CDR
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L1
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3。2.如权利要求1所述的特异性识别HCV的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。3.如权利要求1所述的特异性识别HCV的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。4.一种检测丙型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项中所述的单克隆抗体。5.权利要求1
‑
3任一项中所述的单克隆抗体在制备检测丙型肝炎病毒试剂盒中的应用。6.一种可溶性HCV重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述HCV重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述制备方法包括：构建携带所述HCV重组蛋白基因的表达载体；将所述表达载体导致大肠杆菌表达系统中；高密度发酵培养大肠杆菌；收集大肠杆菌菌体，分离纯化获得可溶性HCV重组蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹先发，柳静，
申请(专利权)人：北京科跃中楷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：