一种中性粒细胞体外扩增培养基制造技术

本发明专利技术提供一种中性粒细胞体外扩增培养基，涉及细胞体外培养领域。所述体外扩增培养基以RPMI1640为基础培养基，根据不同培养阶段向所述基础培养基中加入SCF、G

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞体外扩增培养基


[0001]本专利技术涉及细胞体外培养领域，特别是涉及一种中性粒细胞体外扩增培养基。

技术介绍

[0002]中性粒细胞由骨髓释放，占血液白细胞总数的60
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70％，是白细胞中数量最多的一种，是血液中的主要吞噬细胞。中性粒细胞胞浆中含有初级和次级两种颗粒，初级颗粒较大，即溶酶体颗粒，内含髓过氧化物酶、酸性磷酸酶和溶菌酶；次级(特殊)颗粒较小，内含碱性磷酸酶、溶菌酶、防御素和杀菌渗透增强蛋白等。中性粒细胞是急性炎症反应中的主要效应细胞，从骨髓中释放出来的中性粒细胞在众多趋化因子的作用下聚集于炎症部位，发挥吞噬杀灭细菌、抵抗感染的作用，是机体自我保护、自我修复的生理性反应之一。
[0003]目前，中性粒细胞主要来源于骨髓造血干细胞，经分化形成。由于中性粒细胞的寿命较短，在结缔组织中仅存活2
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3天，并且难以在离体环境中实现有效扩增，现有技术中的中性粒细胞培养基大多仅能实现中性粒细胞的短暂存活培养，难以满足生物实验研究中的大量需求，并且中性粒细胞自外周血分离后的生物活性易发生改变，不利于耗时较长的生物实验研究。因此，亟需提供一种适合中性粒细胞体外扩增培养的培养基，在保证其生物活性以及细胞的正常功能前提下，使中性粒细胞能够得到有效扩增并延长其体外存活时间。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种中性粒细胞体外扩增培养基，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供的培养基能够实现中性粒细胞的有效离体扩增，并且延长中性粒细胞体外环境下的存活期。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种中性粒细胞体外扩增培养基，所述体外扩增培养基以RPMI 1640为基础培养基，根据不同培养阶段向所述基础培养基中加入SCF、G
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CSF、Flt
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3L、IFN
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α和Q
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VD
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OPH中的一种或几种的组合；所述RPMI 1640中含有体积分数为10％的胎牛血清；所述不同培养阶段包括造血干细胞的扩增阶段和中性粒细胞的分化扩增阶段。
[0007]进一步地，在所述造血干细胞的扩增阶段，向所述基础培养基中加入SCF、G
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CSF和Flt
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3L，其中，所述SCF的终浓度为120
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150ng/mL；所述G
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CSF的终浓度为100
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120ng/mL；所述Flt
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3L的终浓度为100
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120ng/mL；在所述中性粒细胞的分化扩增阶段，向所述造血干细胞的扩增阶段的培养基中加入IFN
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α和Q
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VD
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OPH，所述IFN
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α的终浓度为15
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20IU/mL；所述Q
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VD
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OPH的终浓度为40
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60μM。
[0008]本专利技术还提供一种所述的体外扩增培养基在中性粒细胞体外扩增培养中的应用。
[0009]进一步地，所述中性粒细胞由人脐带血中的CD34
+
造血干细胞分化获得。
[0010]进一步地，通过如下方法对中性粒细胞进行扩增：先从人脐带血中提取分离CD34
+
造血干细胞，再对所述CD34
+
造血干细胞进一步扩增培养，诱导分化，最终获得中性粒细胞。
[0011]进一步地，所述从人脐带血中提取分离CD34
+
造血干细胞的方法包括：取新鲜人脐
Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman andA.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0021]实施例1
[0022]1.CD34
+
造血干细胞的分离与扩增：
[0023](1)将获得的新鲜人脐带血与无菌PBS(pH7.2)等体积混匀，按混溶后脐带血总体积与淋巴细胞分离液(Ficoll)为4:3的体积比计算，在无菌离心管中先加入Ficoll之后将人脐带血缓慢地加到Ficoll上面使之浮在Ficoll上层；
[0024](2)待全部加入完毕后小心将离心管取出进行离心，2000rpm、30分钟，离心结束后取出可见的白色膜状层即单核细胞层，使用1000μL微量加样枪把将白色膜状层吸出到空50ml离心管中备用；
[0025](3)加无菌PBS补足体积到40ml并混匀，取少量溶液在细胞计数仪上进行细胞计数；
[0026](4)使用Miltenyi Biotec公司CD34微磁珠标记试剂盒，以下操作按试剂盒说明进行。上述液体离心后保留沉淀；按照计数结果，每108个细胞加300μL分选缓冲液、100μLFcR阻断剂、100μL微珠标记抗CD34抗体，4℃孵育30分钟；
[0027](5)每108个细胞加10mL缓冲液洗涤后离心弃上清，将沉淀收集后用总体积为5mL的缓冲液重悬细胞；
[0028](6)安装好Separation Columns，用3ml BufferA(含0.5％BSA，终浓度2mM EDTA的PBS溶液)分选缓冲液润洗柱子；待液体流尽，取5ml样本于柱子内进行上样；之后用3ml缓冲液BufferA洗柱子去除杂质并重复3次。待液体流尽最后加入5ml分选缓冲液，取下柱子迅速安好注射器后用力将注射器推到底部收集流出液；
[0029](7)用分选缓冲液补充收集的液体体积至10ml并进行细胞计数，将液体在1200rpm条件下离心10分钟后去上清，备用；
[0030](8)根据获得的细胞总数取部分细胞加入干细胞培养液进行如下方案培养。
[0031]2.检测不同培养基中CD34
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造血干细胞的扩增情况
[0032]以RPMI 1640(购自Merck公司，产品货号为R0883
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100ML，含有体积分数为10％的胎牛血清)为基础培养基，培养分为两个阶段，第一阶段为造血干细胞的扩增阶段，向所述基础培养基中加入SCF、G
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CSF和Flt
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3L，培养7
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8天，第二阶段为中性粒细胞的分化扩增阶段，向所述造血干细胞的扩增阶段的培养基中再加入IFN
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α和Q
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VD
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OPH，培养9
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10天。在两个培养阶段中对添加物质的种类进行调整，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞体外扩增培养基，其特征在于，所述体外扩增培养基以RPMI1640为基础培养基，根据不同培养阶段向所述基础培养基中加入SCF、G
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CSF、Flt
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3L、IFN
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α和Q
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VD
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OPH中的一种或几种的组合；所述RPMI1640中含有体积分数为10％的胎牛血清；所述不同培养阶段包括造血干细胞的扩增阶段和中性粒细胞的分化扩增阶段。2.根据权利要求1所述的体外扩增培养基，其特征在于，在所述造血干细胞的扩增阶段，向所述基础培养基中加入SCF、G
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CSF和Flt
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3L，其中，所述SCF的终浓度为120
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150ng/mL；所述G
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CSF的终浓度为100
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120ng/mL；所述Flt
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3L的终浓度为100
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120ng/mL；在所述中性粒细胞的分化扩增阶段，向所述造血干细胞的扩增阶段的培养基中加入IFN
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α和Q
‑
VD
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OPH，所述IFN
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α的终浓度为15
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔思远，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：