一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用，涉及外泌体分离检测技术领域。本发明专利技术提供了一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法，能够实现人外周血或血清中性粒细胞外泌体的磁性分离，同时可以通过简单的流式细胞仪进行中性粒细胞外泌体丰度的快速检测，具有较高的灵敏度和特异度。将本发明专利技术方法应用于胃癌患者及正常人血清样本，发现胃癌患者血清中中性粒细胞外泌体丰度显著高于正常人，可将中性粒细胞外泌体作为胃癌早期诊断的潜在血清肿瘤标志物。清肿瘤标志物。清肿瘤标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用


[0001]本专利技术属于外泌体分离检测
，具体涉及一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用。

技术介绍

[0002]胃癌(gastric carcinoma，GC)是世界癌症死亡的重要原因。由于缺乏具有高灵敏度和特异度的诊断标志物，患者常在晚期确诊，导致较差的预后。目前常用的胃癌血清肿瘤标志物包括AFP、CEA、CA199、CA125、CA724等，虽然有助于胃癌的早期诊断，但仍存在假阳性、假阴性等问题。与传统的血清肿瘤标志物相比，外泌体在肿瘤诊断中显示出诸多优势。中性粒细胞是癌症发生发展的重要参与者，已被证明可以在各种癌症中促进癌变、肿瘤生长转移、血管生成和免疫抑制。然而，中性粒细胞外泌体很少被研究用于肿瘤诊断。因此，构建中性粒细胞外泌体的分离及检测方法，实现对胃癌患者及正常人血清中性粒细胞外泌体的分离检测，对胃癌的早期诊断具有重要意义。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用，实现不同血液样本中中性粒细胞外泌体的磁性分离，同时可以通过简单的流式细胞仪进行中性粒细胞外泌体丰度的快速检测，具有较高的灵敏度和特异度，可作为胃癌的潜在早期诊断生物标志物。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法，包括以下步骤：
[0006](1)将从不同血液样本中提取得到的外泌体与CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠，得捕获中性粒细胞外泌体的磁珠；
[0007](2)利用BSA溶液重悬步骤(1)所述捕获中性粒细胞外泌体的磁珠，将BSA溶液重悬后的磁珠分为实验组和对照组，实验组与鼠抗人CD63一抗混合孵育，对照组加入与实验组一抗等量的BSA溶液混合孵育，然后在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠；
[0008](3)利用BSA溶液重悬步骤(2)所述洗涤后的磁珠与荧光蛋白标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，将磁珠分散于PBS缓冲液中，进行流式检测；
[0009](4)以实验组相对于对照组的相对荧光强度指示中性粒细胞外泌体的丰度。
[0010]优选的，步骤(1)所述血液样本包括外周血和/或血清。
[0011]优选的，从外周血中性粒细胞培养上清中提取外泌体的方法，包括：分离提取人外周血中性粒细胞，收集中性粒细胞培养上清；差速离心后使用100kDa MWCO超滤离心管进行浓缩，超速离心法提取外周血中性粒细胞培养上清外泌体；
[0012]从血清中提取外泌体的方法，包括：去除血清样本中的血小板和大分子量蛋白后吸取上层透明血清，PBS缓冲液进行稀释，100000g离心3h，沉淀为血清外泌体。
[0013]优选的，步骤(1)所述CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液的制备方法，包括将兔抗人CD66b抗体与超顺磁性M
‑
270环氧树脂微球充分旋转孵育，形成CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液。
[0014]优选的，所述兔抗人CD66b抗体与磁珠的比例为6μg抗体/1mg磁珠；所述旋转孵育包括在37℃孵育18h；所述免疫磁珠分散液的浓度为5
‑
15mg/mL。
[0015]优选的，步骤(1)所述外泌体与CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液的质量体积比为2μg：15μL；
[0016]所述混合孵育包括4℃孵育16h。
[0017]优选的，步骤(2)中所述BSA溶液体积百分含量为2％；
[0018]所述BSA溶液与鼠抗人CD63一抗的体积比为50：1，且所述鼠抗人CD63一抗的稀释比为1：50。
[0019]优选的，步骤(3)中所述BSA溶液的质量百分含量为2％；
[0020]所述BSA溶液与荧光蛋白标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗的体积比为100：1，且所述荧光蛋白标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗的稀释比为1：100。
[0021]优选的，步骤(3)所述荧光蛋白包括FITC。
[0022]本专利技术还提供了利用上述分离检测方法得到的中性粒细胞外泌体在制备胃癌早期诊断试剂中的应用。
[0023]有益效果：本专利技术提供了一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法，能够实现人外周血或血清中性粒细胞外泌体的快速磁性分离，同时可以通过简单的流式细胞仪进行中性粒细胞外泌体丰度的快速检测，具有较高的灵敏度和特异度。将本专利技术方法应用于胃癌患者及正常人血清样本，发现胃癌患者血清中性粒细胞外泌体丰度显著高于正常人，可以将中性粒细胞外泌体作为胃癌早期诊断的潜在血清肿瘤标志物。
附图说明
[0024]图1为磁珠
‑
抗体成功偶联的荧光显微镜及流式表征图；
[0025]图2为免疫磁珠成功分离捕获中性粒细胞外泌体的荧光显微镜表征图；
[0026]图3为免疫磁珠捕获中性粒细胞外泌体的表征鉴定图；
[0027]图4为中性粒细胞外泌体检测方法的方法学评价图；
[0028]图5为胃癌及正常人血清中性粒细胞外泌体丰度检测的流式结果图。
具体实施方式
[0029]本专利技术提供了一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法，包括以下步骤：
[0030](1)将从不同血液样本中提取得到的外泌体与CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠，得捕获中性粒细胞外泌体的磁珠；
[0031](2)利用BSA溶液重悬步骤(1)所述捕获中性粒细胞外泌体的磁珠，将BSA溶液重悬后的磁珠分为实验组和对照组，实验组与鼠抗人CD63一抗混合孵育，对照组加入与实验组
一抗等量的BSA溶液混合孵育，然后在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠；
[0032](3)利用BSA溶液重悬步骤(2)所述洗涤后的磁珠与荧光蛋白标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，将磁珠分散于PBS缓冲液中，进行流式检测；
[0033](4)以实验组相对于对照组的相对荧光强度指示中性粒细胞外泌体的丰度。
[0034]本专利技术将从不同血液样本中提取得到的外泌体与CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠，得捕获中性粒细胞外泌体的磁珠。本专利技术所述血液样本优选包括外周血和/或血清。
[0035]本专利技术所述外周血中性粒细胞培养上清外泌体的提取方法，优选包括：分离提取人外周血中性粒细胞，收集中性粒细胞培养上清；差速离心后使用100kDa MWCO超滤离心管进行浓缩，超速离心法提取外周血中性粒细胞培养上清外泌体。本专利技术对所述人外周血中性粒细胞的提取分离提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规分离提取方法即可。本专利技术所述差速离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将从不同血液样本中提取得到的外泌体与CD66b抗体包被的免疫磁珠分散液混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠，得捕获中性粒细胞外泌体的磁珠；(2)利用BSA溶液重悬步骤(1)所述捕获中性粒细胞外泌体的磁珠，将BSA溶液重悬后的磁珠分为实验组和对照组，实验组与鼠抗人CD63一抗混合孵育，对照组加入与实验组一抗等量的BSA溶液混合孵育，然后在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，并利用PBS缓冲液洗涤磁珠；(3)利用BSA溶液重悬步骤(2)所述洗涤后的磁珠与荧光蛋白标记的山羊抗鼠IgG荧光二抗混合孵育，在磁力作用下使磁珠富集，弃去上清，将磁珠分散于PBS缓冲液中，进行流式检测；(4)以实验组相对于对照组的相对荧光强度指示中性粒细胞外泌体的丰度。2.根据权利要求1所述分离检测方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样本包括外周血和/或血清。3.根据权利要求2所述分离检测方法，其特征在于，从外周血中性粒细胞培养上清中提取外泌体的方法，包括：分离提取人外周血中性粒细胞，收集中性粒细胞培养上清；差速离心后使用100kDaMWCO超滤离心管进行浓缩，超速离心法提取外周血中性粒细胞培养上清外泌体；从血清中提取外泌体的方法，包括：去除血清样本中的血小板和大分子量蛋白后吸取上层透明血清，PBS缓冲液进行稀释，100000g离心3h，沉淀为血清外泌体。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张徐，于丹，张家慧，许文荣，钱晖，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：