地塞米松诱导中性粒细胞产生的细胞外囊泡在制备治疗消炎药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了地塞米松在诱导中性粒细胞产生细胞外囊泡中的应用。还公开了地塞米松诱导中性粒细胞产生的细胞外囊泡在制备治疗消炎药物中的应用。地塞米松的刺激会使中性粒细胞内的抗炎因子IL

Application of extracellular vesicles produced by neutrophils induced by dexamethasone in the preparation of anti-inflammatory drugs

【技术实现步骤摘要】
地塞米松诱导中性粒细胞产生的细胞外囊泡在制备治疗消炎药物中的应用


[0001]本专利技术涉及地塞米松诱导中性粒细胞产生的细胞外囊泡在制备治疗消炎药物中的应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是细胞分泌的具有膜结构的纳米级小泡，能够携带蛋白质、脂质、miRNA、lncRNA和DNA等多种生物分子，其封闭膜结构能有效保护相应生物分子活性。同时EVs能够继承亲代细胞的受体和配体，并由于其纳米级别尺寸，有助于其在体内穿越各种生理屏障并能在特定器官及组织细胞中富集。所以细胞外囊泡可通过其包裹的生物分子调控靶细胞功能，是重要的细胞间通讯交流方式。此外，作为一种天然的生物囊泡，EVs还具有低毒性和低免疫原性、生物相容性好等优点，因此基于细胞外囊泡的生物疗法具有很好的临床应用前景。
[0003]中性粒细胞是机体重要的免疫细胞种群，由于其具有很强的趋化性，能在发病早期跨血管内皮细胞到达病灶部位，所以在炎症相关疾病以及抵御病原物感染过程中发挥重要作用。中性粒细胞跨血管迁移至病变部位首先需要黏附于病变部位的血管内皮细胞，随后细胞变形逸出血管到达炎症组织部位。中性粒细胞来源细胞外囊泡可继承中性粒细胞膜的性质，比如中性粒细胞来源细胞外囊泡表面同样富含Integrinβ2，提示其同样具有较好的炎症组织靶向性能。但是细胞外囊泡的制备效率一直是制约其大规模应用的关键因素。所以寻找新的刺激物在保证囊泡继承亲本细胞特性的同时并能有效提升其产生效率显得尤为重要。

技术实现思路
/>[0004]本专利技术的目的是提供地塞米松在诱导中性粒细胞产生细胞外囊泡中的应用。
[0005]本专利技术的另一目的是提供地塞米松诱导中性粒细胞产生的细胞外囊泡在制备治疗消炎药物中的应用。
[0006]有益效果：地塞米松的刺激会使中性粒细胞内的抗炎因子IL
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10和TGF
‑
β的表达水平显著上调；且中线粒细胞经地塞米松刺激后，囊泡制备产率较未处理中性粒细胞组至少提升10倍。可见，地塞米松具有促进中线粒细胞分泌囊泡的作用，且地塞米松刺激中性粒细胞产生的囊泡，不但IL
‑
10和TGF
‑
β含量显著提升，而且具有更好的血管内皮黏附能力和抗炎活性，有望发展成为一种新型的生物治疗技术，可用于临床难治性炎性相关疾病的治疗。
附图说明
[0007]图1、中性粒细胞来源细胞外囊泡的透射电子显微镜分析图。
[0008]图2、中性粒细胞来源细胞外囊泡的纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)分析图。
[0009]图3、体外检测该囊泡的血管内皮粘附能力。
[0010]图4、体外评估该囊泡对血管内皮细胞的抑炎作用。
[0011]图5、体外评估该囊泡对巨噬细胞的抗炎活性(qRT
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PCR)。
[0012]图6、体外评估该囊泡对巨噬细胞的抗炎活性(ELISA)。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0014]从地塞米松诱导的中性粒细胞中分离细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
[0015]1)地塞米松刺激中性粒细胞两天；
[0016]2)细胞室温300g离心5min，去除细胞；
[0017]3)取上清，室温2000g离心10min，去除细胞碎片；
[0018]4)取上清，4℃160000g离心1h，离心管底部白色微絮状沉淀即为细胞外囊泡。
[0019]S1、表征前述获得的中性粒细胞来源细胞外囊泡的形态特征，通过透射电子显微镜(TEM)(如图1)和纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)(如图2)分析该囊泡的形态与粒径。
[0020]S2、该囊泡的血管内皮黏附能力检测。首先在孔板中培养单层人脐静脉内皮细胞HUVEC，使用LPS活化细胞，随后固定细胞形态；将DiI染料标记的囊泡与固定过的HUVEC细胞共孵育6h或12h后通过免疫荧光观察其黏附情况。实验结果证明，经LPS刺激活化后HUVEC细胞表面ICAM
‑
1表达显著上升，将有助于中性粒细胞来源囊泡黏附至血管内皮细胞，因此能够观察到相较于正常的脐静脉内皮细胞，经LPS活化的细胞黏附更多的囊泡，并且随着孵育时间延长，黏附在活化的HUVEC细胞表面的囊泡量逐渐累积(如图3)。相关结果表明，分离的中性粒细胞来源的囊泡具有较强血管黏附能力，能够更有效地黏附于炎性状态下的血管内皮细胞，这对于后续EVs在炎症部位靶向和富集是尤为重要的。
[0021]S3、在检测囊泡血管黏附能力的同时，也测定了EVs对LPS活化的HUVEC细胞的炎症抑制作用。将NC
‑
EVs和Dex
‑
EVs与活化的细胞共孵育24h后，收集细胞检测相关基因表达情况。实验结果表明LPS活化后炎症因子表达上调，如IL
‑
1β、IL
‑
6、TNF
‑
α及单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP
‑
1)等，其中MCP
‑
1基因上升较为显著，约上升12倍。同时相较于NC
‑
EVs，Dex
‑
EVs对活化的HUVEC细胞具有显著抑炎作用，显著下调相关促炎因子水平(图4)。
[0022]S4、通过qRT
‑
PCR和ELISA检测手段评价了EVs对LPS活化的Raw264.7细胞的抗炎作用。从基因的mRNA水平评价Dex
‑
EVs对活化巨噬细胞的炎症抑制作用，结果表明LPS活化的巨噬细胞摄取Dex
‑
EVs后，IL
‑
10的mRNA水平上调，约为Control组的20倍，同时IL
‑
1β、IL
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6和TNF
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α等促炎因子表达水平显著下调(图5)；还检测了Raw264.7细胞培养上清液中炎性细胞因子的分泌情况，结果如图所示，摄取Dex
‑
EVs的细胞上清液中上述促炎介质含量显著降低，同时IL
‑
10分泌量大大提升，约达4000pg/ml，这对于后续Raw264.7细胞发挥抗炎活性乃至消除炎症反应是很关键的(图6)。相比之下，Raw264.7细胞吞噬NC
‑
EVs后，其炎性因子水平相比于LPS单独处理组并无显著差异。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.地塞米松在诱导中性粒细胞产生细胞外囊泡中的应用。2.地塞米松诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄振，肖琳，崔芷莹，陈江宁，张峻峰，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：